拟南芥和菘蓝SEP3基因不同剪接本以及菘蓝IiSEP1和IiSEP2基因功能研究

论文摘要

本工作研究了拟南芥和菘蓝SEP3直系同源基因不同剪接本以及菘蓝E类花同源异型基因IiSEP1和IiSEP2的生物学功能。拟南芥的AtSEP3基因和菘蓝的IiSEP3基因具有同样的剪接方式,可以产生全长剪接本（AtSEP3-2与IiSEP3-2）和缺少第六个外显子的可变剪接本（AtSEP3-3与IiSEP3-3）,这种保守的剪接方式对植物生长过程可能具有重要的调节功能。IiSEP3-2、IiSEP3-3、IiSEP1和IiSEP2蛋白的N-末端都存在一个核定位信号KRIENKINRQVTFAKRR,它们均定位于细胞核中。对氨基酸序列进行分析,发现这几个蛋白质的C末端都有三个保守的基序,分别为SEP motifⅠ（FFQPLE）、SEP/AGL6motif（PILQIGY）和SEP motifⅡ（NNYMLGWLP）,所以这几种蛋白质可能具有冗余性功能。采用qRT-PCR技术对AtSEP3-2、AtSEP3-3、IiSEP3-2和IiSEP3-3四种剪接本以及IiAP1、IiSEP1和IiSEP2基因在转录水平的表达模式进行分析,结果表明IiAP1和AtAP1存在相似的表达模式,在营养生长阶段不表达,在花序、花、花萼和花瓣中表达,且在花序中的表达水平最高;IiSEP1、IiSEP2、AtSEP1和AtSEP2在营养生长阶段不表达,但在生殖生长阶段高水平表达;IiSEP1在短角果中的转录水平最高,而AtSEP1在雌蕊中的表达水平达到峰值;IiSEP2转录本在花瓣中的丰度最高,而AtSEP2转录本在雄蕊中的数量达到峰值;IiSEP3-2和AtSEP3-2在根和茎中不表达,在叶片中表达量很低;在花器官中,SEP3-2剪接本的表达水平明显增加,IiSEP3-2在花瓣中出现峰值,AtSEP3-2在角果中丰度最高;IiSEP3-3和AtSEP3-3在根和茎中几乎检测不到信号,而在叶片中开始积累;IiSEP3-3在花瓣中的积累数量达到峰值,而AtSEP3-3在雌蕊中的丰度最高。同时,从蛋白质水平分析了AtSEP3-2、AtSEP3-3、IiSEP3-2和IiSEP3-3在不同组织和器官中的积累数量。Western blotting实验结果表明,在菘蓝的根和茎中检测不到IiSEP3-2和IiSEP3-3信号,但在莲座叶和花中可以检测到IiSEP3-2蛋白,在莲座叶、茎生叶和花中能够检测到IiSEP3-3蛋白。在拟南芥中,仅在花、雄蕊和雌蕊中能够检测到AtSEP3-2信号,而AtSEP3-3除了在根和茎中检测不到信号以外在其他组织和器官中都能够表达。以上结果表明,AtSEP3-2、AtSEP3-3、IiSEP3-2和IiSEP3-3四种剪接本具有不同的表达模式,它们在开花转变和花器官形成过程中可能具有不同的调节功能。在此基础上,利用人工miRNA（artificial miRNA,amiRNA）技术分别对AtSEP3-2和AtSEP3-3剪接本进行了沉默,分析了AtSEP3-2和AtSEP3-3在拟南芥生长发育过程中所发挥的功能。与野生型拟南芥相比,miR-sep3-2和miR-sep3-3转基因拟南芥植株在营养阶段的生长状态更加旺盛,叶片面积变大,叶片边缘呈现出明显的缺刻表型。此外,在miR-sep3-2转基因拟南芥植株中花萼和花瓣的排列方式也发生了改变。转录组测序结果表明,miR-sep3-2转基因植株中共有1116个基因的表达水平发生了变化,其中有559个基因上调,557个基因下调;miR-sep3-3转基因植株中共有1347个基因的mRNA积累水平发生了改变,其中879个基因上调,468个基因下调。进一步通过染色质免疫共沉淀技术（chromatin immunoprecipitation,ChIP）对AtSEP3不同剪接本编码产物调控的下游基因进行了分析,发现AtSEP3-2能够直接结合至AGL17、AGL20、AGL42、ARF17、CCA1、FT、GI、GRF8、LFY、SEP3、SHP1、STM、TCP3、TCP12和TT16等基因的启动子区,间接控制AGL15、AGL24、AGL96、MAF、SHP2、LHY、TCP2和TCP23等基因的转录过程;AtSEP3-3可以直接调控AGL15、AGL24、ARF17、CUC2、GI、GRF8、MAF5、SEP3、SHP1、STM和TT16等基因的表达活性,间接控制AGL17、AGL20、AGL42、FT和LHY等基因的转录过程。这些结果说明拟南芥AtSEP3基因的两种剪接本在功能上存在差异。在拟南芥中组成性表达菘蓝的IiSEP3-2、IiSEP3-3、IiSEP1和IiSEP2都可以引起早花,花器官的发育也出现异常。与野生型拟南芥相比,35S::IiSEP3-2、35S::IiSEP3-3、35S::IiSEP1和35S::IiSEP2转基因拟南芥株系不仅早花,而且呈现出矮化表型。35S::IiSEP3-2、35S::IiSEP3-3和35S::IiSEP1转基因拟南芥植株的莲座叶向上卷曲,而35S::IiSEP2转基因拟南芥植株的莲座叶并没有发生明显变化。在IiSEP3-2转基因拟南芥植株中,萼片、花瓣和雄蕊数目减少,茎生叶和花萼发育为类似心皮的结构。在IiSEP3-3转基因拟南芥植株中,萼片、花瓣和雄蕊数目减少甚至缺失,花粉不能完全发育,四轮花器官过早萎蔫,整个花呈败育状态。35S::IiSEP1转基因拟南芥株系的花在形态上也不正常,花器官会发生同源异型转变。35S::IiSEP2转基因株系的花瓣发育异常,花萼和雄蕊数量减少,花萼转变成类似心皮的结构。采用基于烟草脆裂病毒的VIGS技术沉默菘蓝中的IiSEP3-2和IiSEP3-3剪接本,可以使菘蓝的开花时间推迟,花器官的正常发育过程也被扰乱。与对照组菘蓝植株相比,用TRV-IiSEP3-2和TRV-IiSEP3-3处理后菘蓝植株的营养生长时间明显延长,花瓣和雄蕊数量减少,花药发育异常。此外,用TRV-IiSEP3-3处理后菘蓝的花萼在数量上也会减少,花瓣的形状明显改变。转录组测序结果显示,在TRV-IiSEP3-2处理的菘蓝植株中有1861个基因的表达水平发生了变化,1035个基因上调,826个基因下调;在TRV-IiSEP3-3处理的菘蓝植株中有2063个基因的表达水平发生改变,其中1289个基因被促进,774个基因被抑制。以上结果说明,IiSEP3基因与开花转变过程有关,它的剪接本被沉默以后菘蓝植株将不能从营养生长阶段正常地进入生殖生长阶段。酵母双杂交实验结果表明,IiSEP3-2与IiSEP1、IiSEP2、IiSEP4、IiSVP、和IiSHP2具有相互作用,但与IiFUL没有相互作用;IiSEP3-3与IiSEP1、IiSEP4和IiSVP能够形成异二聚体,但与IiSEP2、IiSHP2和IiFUL不能形成异二聚体。这些结果说明,IiSEP3-2和IiSEP3-3具有不同的互作蛋白,它们在功能上存在差异。综上可得,拟南芥的AtSEP3-2和AtSEP3-3能够调节不同的下游基因,参与叶片的形态建成和花器官发育过程。菘蓝的IiSEP3-2和IiSEP3-3可以和不同的蛋白质相互作用,影响开花转变和花器官发育过程。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 可变剪接在植物中的研究进展
•     1.1.1 可变剪接的类型与发生机制
•     1.1.2 可变剪接在植物中的特征
•     1.1.3 可变剪接在生物胁迫中的功能
•     1.1.4 可变剪接对非生物胁迫应答反应的调控作用
•     1.1.5 可变剪接对昼夜节律的调节作用
•     1.1.6 可变剪接对植物MADS蛋白功能的影响
•   1.2 MIKC型MADS蛋白在植物中的研究进展
•     1.2.1 MIKC型MADS蛋白的结构
•     1.2.2 ABCDE开花模型
•     1.2.3 E类MADS-box基因在植物中的功能研究
•     1.2.4 拟南芥SEP3基因不同剪接本的研究进展
•   1.3 主要研究内容与方案
•     1.3.1 研究意义
•     1.3.2 研究内容
•     1.3.3 研究方案
•   1.4 本研究的特色与创新之处
• 第二章 菘蓝开花基因表达模式分析及编码产物的亚细胞定位
•   2.1 实验材料
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 qRT-PCR引物
•     2.2.2 进化树构建
•     2.2.3 实时定量PCR
•     2.2.4 SEP3-2和SEP3-3抗体制备
•     2.2.5 Western blotting实验
•     2.2.6 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备与转化
•     2.2.7 瞬时表达与亚细胞定位
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 Ii AP1、IiSEP1、IiSEP2、IiSEP3-2和IiSEP3-3蛋白的结构特征
•     2.3.2 Ii AP1、IiSEP1、IiSEP2、IiSEP3-2和IiSEP3-3进化分析
•     2.3.3 表达模式分析
•     2.3.4 SEP3-2和SEP3-3蛋白特异性抗体的获得
•     2.3.5 SEP3-2和SEP3-3蛋白的表达分析
•     2.3.6 蛋白质建模和亚细胞定位
•   2.4 讨论
• 第三章 拟南芥SEP3-2和SEP3-3功能研究
•   3.1 实验材料
•   3.2 引物设计
•     3.2.1 人工miRNA引物的设计
•     3.2.2 染色质免疫共沉淀PCR引物的设计
•     3.2.3 拟南芥qRT-PCR引物的设计
•   3.3.实验方法
•     3.3.1 miRNA172a-pRI 101-AN重组质粒的构建
•     3.3.2 人工miRNA（amiRNA）载体的构建
•     3.3.3 染色质免疫共沉淀实验（ChIP assay）
•   3.4.实验结果
•     3.4.1 人工miRNA设计
•     3.4.2 转基因拟南芥植株的鉴定
•     3.4.3 AtSEP3-2和AtSEP3-3对拟南芥生长和叶片发育的影响
•     3.4.4 AtSEP3-2和AtSEP3-3对拟南芥花器官发育的影响
•     3.4.5 miRNA-SEP3-2和miRNA-SEP3-3转基因植株基因表达的差异分析
•     3.4.6 AtSEP3-2和AtSEP3-3对AS、SNP及InDel等事件的影响
•     3.4.7 AtSEP3-2和AtSEP3-3下游基因的确定
•   3.5.讨论
• 第四章 菘蓝IiSEP3-2和IiSEP3-3剪接本以及IiSEP1和IiSEP2基因对拟南芥开花时间和花器官发育的影响
•   4.1 实验材料和引物
•     4.1.1 实验材料
•     4.1.2 转基因植株鉴定引物和开花基因qRT-PCR引物的设计
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 根癌农杆菌介导的遗传转化
•     4.2.2 转基因拟南芥植株的筛选、鉴定和表型观察
•     4.2.3 转基因拟南芥中开花和叶片发育相关基因的表达分析
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 转基因拟南芥株系的获得及鉴定
•     4.3.2 菘蓝E类基因对拟南芥开花时间及叶片发育的影响
•     4.3.3 IiSEP3-2和IiSEP3-3转基因拟南芥植株的表型观察
•     4.3.4 IiSEP1和IiSEP2转基因拟南芥的表型观察
•     4.3.5 IiSEP3-2和IiSEP3-3转基因植株中开花和叶片发育相关基因的活性
•   4.4 讨论
• 第五章 利用VIGS技术研究IiSEP3基因的功能
•   5.1 实验材料
•   5.2 引物设计
•   5.3 实验方法
•     5.3.1 IiPDS保守性结构域编码序列的扩增
•     5.3.2 pTRV2-IiSEP3-2载体的构建
•     5.3.3 pTRV2-IiSEP3-3和pTRV2-IiPDS载体的构建
•     5.3.4 病毒诱导的基因沉默
•     5.3.5 双分子荧光互补实验（BiFC）
•     5.3.6 酵母双杂交实验（Y2H）
•   5.4 实验结果
•     5.4.1 IiPDS保守性结构域编码序列的获得
•     5.4.2 pTRV2-IiPDS、pTRV2-IiSEP3-2和pTRV2-IiSEP3-3载体的构建
•     5.4.3 IiPDS沉默导致菘蓝叶片呈漂白表型
•     5.4.4 TRV-IiSEP3-2和TRV-IiSEP3-3处理后菘蓝植株的表型变化
•     5.4.5 TRV-IiSEP3-2和TRV-IiSEP3-3处理后菘蓝植株在转录组水平的差异
•     5.4.6 TRV-IiSEP3-2和TRV-IiSEP3-3处理组差异表达基因的qRT-PCR验证
•     5.4.7 IiSEP3-2和IiSEP3-3与菘蓝MADS蛋白的相互作用
•   5.5 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间取得的科研成果
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 博士论文

作者: 马燕勤

导师: 徐子勤

关键词: 拟南芥,菘蓝,可变剪接,叶片形态建成,花器官发育

来源: 西北大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 西北大学

分类号: Q943.2

DOI: 10.27405/d.cnki.gxbdu.2019.000352

总页数: 185

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