产碱性蛋白酶菌株BN-2的鉴定及其重组酶的酶学性质表征

论文摘要

蛋白酶是能将蛋白质降解为小肽和氨基酸的水解酶,碱性蛋白酶（Alkaline protease,AP）作为在碱性环境下活力较高、稳定性较好的一类蛋白酶,其在洗涤剂、生物修复、废物管理、摄影、诊断等工业中均有应用。微生物源碱性蛋白酶因生产成本低、生产率高可满足工业上的需求,成为碱性蛋白酶生产的重要来源,在微生物中,细菌和真菌是各种碱性蛋白酶的良好来源。目前,芽孢杆菌属细菌如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜碱性芽孢杆菌等是适用于工业生产的主要产酶菌株。本文主要从自然环境中筛选出一株产酶活性较高的菌株,并对菌株中碱性蛋白酶进行了相关研究。首先,从自然发酵的大豆中分离出一株产蛋白酶活性较高的菌株BN-2,结合形态学、分子生物学鉴定该菌种为Bacillus subtilis subsp.natto BEST195。然后通过CTAB法成功提取了BN-2菌株中基因组DNA,利用PCR技术扩增出该菌株中碱性蛋白酶（Alkaline protease,AP）基因,插入pBE2R载体中,构建成重组表达载体pBE2R-AP,并转染枯草芽孢杆菌WB600进行分泌性表达。以糊精、可溶性淀粉作为碳源,每毫升发酵液中重组蛋白酶的酶活约是出发菌株中蛋白酶酶活的1.2倍。将pBE2R载体中p43启动子替换为BN-2菌株中碱性蛋白酶的p195启动子时,每毫升发酵液中p43启动子调控下的碱性蛋白酶酶活约是p195启动子调控下酶活的1.4倍。以酪蛋白为底物对该重组蛋白酶的酶学性质进行了研究,结果表明:该酶的最适作用pH为8.0,在pH 8.0缓冲液中保存24 h,剩余酶活力达94%;该酶的最适作用温度为50℃,在50℃中处理30min时残余酶活力降至51%;1mmol/L的Mn2+使该酶活性提高了48%,1mmol/L的Ca2+使该酶活性提高了8%;洗涤剂组分中1%的TritonX-100对该酶活性有13%的抑制作用,1%的Tween20对该酶活性有8%的抑制作用,1%的Tween80对该酶活性有15%的抑制作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
•   1.1 蛋白酶
•   1.2 碱性蛋白酶
•     1.2.1 碱性蛋白酶的概述
•     1.2.2 碱性蛋白酶的来源
•     1.2.3 微生物源碱性蛋白酶性质
•     1.2.4 微生物源碱性蛋白酶的基因结构、功能
•   1.3 碱性蛋白酶的应用
•     1.3.1 碱性蛋白酶在洗涤剂中的应用
•     1.3.2 碱性蛋白酶在食品中的应用
•     1.3.3 碱性蛋白酶在皮革制造中的应用
•     1.3.4 碱性蛋白酶在其他方面的应用
•   1.4 碱性蛋白酶研究现状
•   1.5 研究的目的及意义
•   参考文献
• 第二章 自然发酵大豆中产碱性蛋白酶菌株筛选、鉴定
•   2.1 前言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 材料
•     2.2.2 试剂、仪器
•     2.2.3 培养基
•     2.2.4 主要溶液的配制
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 产酶菌株的筛选
•     2.3.2 产酶菌株培养及产酶菌株基因组DNA的提取
•     2.3.3 产酶菌株中16SrRNA基因克隆
•     2.3.4 产酶菌株的鉴定
•   2.4 实验结果
•     2.4.1 产酶菌株筛选结果
•     2.4.2 产酶菌株的基因组DNA提取结果及分析
•     2.4.3 产酶菌株中16SrRNA基因克隆
•     2.4.4 产酶菌株的鉴定
•   2.5 讨论
•   参考文献
• 第三章 BN-2中碱性蛋白酶基因的克隆、表达及酶特性表征
•   3.1 前言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 菌株与质粒
•     3.2.2 主要仪器与试剂
•     3.2.3 培养基
•     3.2.4 主要溶液的配制
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 枯草芽孢杆菌表达体系的建立
•     3.3.2 产酶菌株中碱性蛋白酶基因（Alkaline protease,AP）克隆
•     3.3.3 酶液制备
•     3.3.4 野生菌BN-2、工程菌WB600/pBE2R-AP产酶活力的比较
•     3.3.5 启动子改变对产酶活性的影响
•     3.3.6 重组蛋白酶部分酶学性质研究
•   3.4 实验结果
•     3.4.1 枯草芽孢杆菌表达体系的建立
•     3.4.2 重组质粒pBE2R-AP构建结果
•     3.4.3 野生菌BN-2、工程菌WB600/pBE2R-AP产酶活力的分析
•     3.4.4 启动子改变对产酶活性影响
•     3.4.5 重组蛋白酶酶学性质研究结果
•   3.5 讨论
•   参考文献
• 附录1 实验材料与试剂
• 附录2 实验仪器
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简况及联系方式

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 魏婷婷

导师: 石亚伟

关键词: 碱性蛋白酶,鉴定,工程菌,启动子,酶学性质

来源: 山西大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 山西大学

分类号: Q78;Q55

DOI: 10.27284/d.cnki.gsxiu.2019.000229

总页数: 63

文件大小: 3446K

下载量: 149