导读:本文包含了基因打靶载体论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:基因打靶,锌指核酸酶(ZFN),Fat1,转基因
基因打靶载体论文文献综述
黄幸,严爱芬,邓廷贤,欧阳宏佳,刘连[1]（2019）在《锌指核酸酶介导的陆川猪Fat1基因打靶载体构建及体外转基因研究》一文中研究指出秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans) Fat1基因翻译产物是ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶,哺乳动物因为缺少这个基因,不能将ω-6多不饱和脂肪酸转化为ω-3多不饱和脂肪酸,因此只能通过饮食获得ω-3多不饱和脂肪酸,以保证ω-6/ω-3的平衡,满足机体的健康所需。为获得整合了Fat1基因且能稳定表达的转基因猪(Sus scrofa),本实验采用锌指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)介导的多位点打靶技术从细胞水平上开展了转基因技术的研究。首先构建了陆川猪Fat1基因打靶载体pCAGGS-DS2-eGFP-Fat1-DS1,并设计和构建了两个靶向陆川猪r DNA基因中内转录间隔区1 (internal transcribed spacer-1, ITS-1)序列的锌指核酸酶真核表达载体pcDNA3.1-NLS-ZFN-R和pcDNA3.1-NLS-ZFN-L。然后从猪的肾脏中成功分离出原代成纤维细胞(primary kidney fibroblast, PKF),通过脂质体共转染将Fat1基因打靶载体和锌指核酸酶载体导入细胞,转染细胞7 d后,提取细胞基因组DNA,PCR检测外源基因整合情况,结果表明Fat1基因成功整合到陆川猪PKF细胞基因组中,本研究为进一步获得转基因猪提供了一定的理论依据。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2019年08期）
黄瑾,陈相好,吴晓娟,张峥嵘,谷俊莹[2]（2019）在《大肠杆菌Targetron基因打靶载体构建及应用》一文中研究指出目的:构建基于细菌Ⅱ型内含子的Targetron基因打靶载体,并在大肠杆菌中验证其功能。方法:以构建的p SY7载体为基础、以大肠杆菌lac Z基因为例,选择lac Z-1683a和lac Z-1874s位点为靶位点,利用在线设计软件设计打靶引物,通过重迭延伸PCR方法获得特异性打靶序列,并将其克隆到p SY7载体,获得p SY7-lacZ-1683a和p SY7-lacZ-1874s打靶载体,转化大肠杆菌后利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导插入型内含子的表达,最后利用菌落PCR和蓝白斑计数法验证其功能及打靶效率。结果:成功构建了p SY7-lacZ-1683a和p SY7-lac Z-1874s两种Targetron打靶载体,通过0.5 mmol/L IPTG诱导45 min后,菌落PCR显示Ⅱ型内含子能特异性插入到lac Z-1683a、lac Z-1874s位点,蓝白斑计数显示lac Z-1683a位点的打靶效率为(14.299±1.271)%,lac Z-1874s位点的打靶效率为(9.217±1.024)%。结论:构建的Targetron打靶载体能够特异性的插入大肠杆菌染色体靶位点。(本文来源于《贵州医科大学学报》期刊2019年07期）
王智玮,龙中儿,江云,黄运红[3]（2019）在《炭样小单孢菌JXNU-1基因打靶载体的构建》一文中研究指出小单孢菌属放线菌是许多生物活性物质的重要来源,但自然条件下小单孢菌的活性产物产率普遍偏低,基因编辑与改造对提高小单孢菌属放线菌活性产物的产率具有重要意义。然而,有效的遗传转化体系成为小单孢菌属放线菌基因编辑改造的瓶颈。炭样小单孢菌JXUN-1是实验室从南昌瑶湖农田土壤样品中分离到的一株具有广谱抗菌活性的放线菌,其基因组具有GC含量高的特点。本研究以敲除炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素合成相关基因P450为例,以温敏型质粒pKC1139为模板,构建了炭样小单孢菌JXNU-1 P450基因打靶载体p FD306,然后通过电转化将pFD306导入炭样小单孢菌JXNU-1新鲜菌丝体内,通过双交换获得基因缺失株炭样小单孢菌JXNU-ΔP450,最后通过PCR验证了菌株P450基因的缺失,表明炭样小单孢菌JXNU-1基因打靶载体pFD306构建成功。本研究确证了质粒pKC1139可以用于炭样小单孢菌JXNU-1基因组的编辑,为炭样小单孢菌JXNU-1抗生素合成相关基因的筛选及其功能研究提供有效帮助。(本文来源于《基因组学与应用生物学》期刊2019年06期）
孙筱品,董玉梅,汪海燕,谌容,桂飞[4]（2019）在《Neuritin条件性基因打靶载体的构建和同源重组胚胎干细胞克隆鉴定》一文中研究指出Neuritin(Nrn1)是神经营养因子家族的成员,能够维持神经元的存活和突起的生长,在神经系统发育和再生中起重要作用。为了解Neuritin基因在整体动物水平的系统生物学功能,通过PCR扩增Neuritin基因片段,将该片段用In-fusion无缝克隆技术连接至用限制性内切酶Asc1酶切后线性化的CTVIRES-EGFP质粒,转化至Stellar感受态细胞后,对酶切和测序鉴定正确的阳性克隆子进行大量提取质粒,酶切使之线性化后将其电转导入小鼠胚胎干细胞细胞,经G418筛选,挑取抗性克隆,用PCR方法鉴定出同源重组的ES细胞DNA。结果表明,成功构建了CTV-Nrn1-IRES-EGFP基因打靶载体载体并筛选出阳性同源重组胚胎干细胞,为制备Neuritin条件性基因打靶小鼠模型奠定了实验基础。(本文来源于《动物医学进展》期刊2019年04期）
刘晙玭,汪智琼,平光伦,石玉琴,张玲[5]（2015）在《利用新型DNDF7和携带LoxP位点的LPL4质粒快速构建S-Sox5基因打靶载体》一文中研究指出目的体外实验已证实S-SOX5蛋白转录调节运动纤毛基因Spag6,为进一步探索其在体内的作用,拟构建S-Sox5基因的敲除载体。方法利用新型DNDF-7和携带LoxP位点的LPL4载体,选择S-Sox5基因第1外显子作为条件性敲除目的片段,SV129系ES细胞DNA为模板分步扩增包括S-Sox5第1外显子的中间段(middle piece),上游同源左臂4.8kb(upper arm)及下游同源右臂2.5kb(down arm)的基因片段;构建upper-arm-DNDF7、down-armDNDF7和middle-piece-LPL4质粒,将middle-piece-LPL4的酶切产物LoxP-middle-piece-LoxP和down-arm-DNDF7酶切产物相连,形成携带LoxP位点的middle-down-arms-DNDF7重组质粒,该质粒与upper-arm-DNDF7酶切产物相连,获得S-Sox5基因打靶载体。结果经酶切鉴定及测序证实,构建的upper-arm—DNDF7、middle-piece—LPL4、down-arm—DNDF7重组质粒和S-Sox5基因打靶载体结构正确,与设计相符。结论成功构建小鼠S-Sox5条件基因打靶载体,为进一步建立S-Sox5条件敲除小鼠,在体内研究其功能打下基础。(本文来源于《中国男科学杂志》期刊2015年09期）
梁浩,刘慧,韩雪洁,赵宇航,塔娜[6]（2015）在《基础型无启动子基因打靶载体pMCS-IEN的构建及初步检测》一文中研究指出基因打靶是一项以DNA同源重组为基础,在基因水平上进行定向可遗传性修饰的新型分子生物学技术。无启动子基因打靶技术的建立,对于提高基因定点整合效率以及外源基因的正确表达非常重要。本实验通过PCR技术对p IRES2-EGFP中的neor基因片段进行扩增,并在其上下游增加Bam HⅠ和BglⅡ的限制性酶切位点。将得到neor基因片段连接至载体p MD19-T simple Vector上,命名为p MDneo。用Bam HⅠ和BglⅡ对p MD-neo与p EGFP-C1进行酶切,连接目的片段后获得中间质粒p EGFPneo。随后使用Bsp1407Ⅰ和SfiⅠ对p EGFP-neo和p IRES2-EGFP进行酶切、连接构成另一中间质粒p IRES-EGFPneo。通过Bam HⅠ与MluⅠ对p IRES-EGFPneo和p MD-MCS进行酶切,连接目的片段后得到最终的基础型无启动子打靶载体p MCS-IEN。将PGK启动子连入用于克隆上游同源臂的多克隆位点中,并转染Hela细胞对载体进行检测。结果表明,基础型无启动子基因打靶载体上的筛选标记基因可以富集具有G418抗性且绿色荧光表达阳性的细胞克隆,具有较好的生物学活性。本研究为利用基因打靶技术制作转基因动物提供了比较便利、高效的方法策略。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2015年07期）
王越,金镇,孙磊,郑晋华[7]（2015）在《小鼠性激素结合球蛋白条件基因打靶载体的构建》一文中研究指出目的构建小鼠性激素结合球蛋白(Shbg)条件基因打靶载体。方法运用ET克隆的方法构建Shbg基因第4-7号外显子两侧插入loxp位点的条件性剔除载体。首先以BAC DNA为模板克隆出Shbg及其上、下游基因并打靶质粒载体(p BR322-MKAB),利用该质粒和BAC克隆,通过同源重组方式,获得套取质粒(p BR322-Shbg-Re);再分别以PL452及PL451为模板扩增出含Neo片段,经过再一轮的Red/ET重组成功实现条件性基因敲除打靶载体(p BR322-MK-SHBG-cko)的构建。结果经多个限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,构建的p BR322-MK-AB、p BR322-Shbg-Re、SHBG-Ln重组质粒和Shbg条件基因打靶载体(p BR322-MK-SHBG-cko)结构正确,与设计相符。结论成功构建了小鼠Shbg条件基因打靶载体,为后续Shbg基因条件敲除小鼠模型的构建奠定了基础。(本文来源于《中国医科大学学报》期刊2015年03期）
郭慧琴,苏少锋,任卫波,尹俊[8]（2015）在《绒山羊FGF5基因打靶载体的构建》一文中研究指出[目的]构建绒山羊FGF5基因打靶载体,以期获得基因敲除的绒山羊个体,为研究绒山羊FGF5基因的功能以及培养长绒毛型绒山羊新品种提供新思路。[方法]通过PCR法扩增并克隆了绒山羊FGF5基因启动子区和部分第一外显子的1.6 kb片段和部分第一内含子的4.5 kb片段,并将1.6 kb片段插入到打靶载体p Lox的XbaⅠ/ClaⅠ位点,获得了9.6 kb的中间打靶载体p Lox5;再将4.5 kb片段插入到p Lox5的NotⅠ位点,通过酶切和PCR法验证获得了插入方向正确的打靶载体p Lox5-33。[结果]经过酶切和PCR法鉴定,最终获得了大小为14.1 kb的p Lox5-33。[结论]成功构建了绒山羊FGF5基因包含启动子区第一外显子部分序列和第一内含子部分序列的大小为14.1 kb的基因打靶载体p Lox5-33,为进一步获得基因敲除绒山羊个体以及研究绒山羊FGF5基因的功能奠定了基础。(本文来源于《生物技术》期刊2015年01期）
刘婉霞,严爱芬,刘芳,唐冬生[9]（2014）在《基于TALEN技术的多位点基因打靶载体构建和鉴定》一文中研究指出人类基因治疗和转基因动物等都需要外源基因高效、持续稳定表达,本课题组前期建立了独特的多位点基因打靶技术,获得稳定表达的靶位点,但其基因定点插入效率需要进一步提高。转录激活因子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)是一项高效在体基因组编辑技术,拥有定点插入效率高、细胞毒性低的诸多优势。本研究利用在线软件在人基因组rDNA基因序列上寻找到合适的TALEN切割位点,构建以TALEN切割位点为靶位点的人类细胞通用多位点基因打靶载体,该打靶载体包含左右同源重组引导序列DS1和DS2(TALLEN切割位点两侧基因序列)以及标记蛋白表达元件。我们以健康人外周血的基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增DS1和DS2并利用酶切位点HindⅢ、PstⅠ、XbaⅠ和EcoRⅠ分别将两个基因插入到pUC-19多克隆位点中,得到重组质粒pUC-DS卜DS2。采用工n-fusion酶将从真核表达载体pEGFP-N1中扩增EGFP表达元件(pCMV-MCS-EGFP)连接到经PstⅠ和XbaⅠ双酶切pUC-DS1-DS2得到的线性化载体。最终,经酶切鉴定和测序验证,成功构建了人类细胞通用多位点打靶载体"pUC-DS1-pCMV-MCS-EGFP-DS2"。本研究将最新的TALEN技术与本组前期建立的多位点打靶相结合,所构建的通用多位点打靶载体,有望进一步提高基因定点插入效率,可用于不同细胞的基因打靶,为动物转基因和人类疾病基因治疗等工作奠定基础。(本文来源于《广东省遗传学会第九届代表大会暨学术研讨会论文及摘要汇编》期刊2014-12-19）
马小娅,蒋泓,刘芳,唐冬生[10]（2014）在《CRISPR/Cas9介导的水牛多位点基因打靶载体的构建》一文中研究指出同源重组是基因打靶的分子基础,但是细胞内发生同源重组的频率非常低。本研究组近年来从事基因打靶研究,建立了高效多位点基因打靶技术。该技术以rRNA基因间的内部转录间隔重复序列为靶位点,可使外源基因位于活跃的转录单位内,且使基因定点整合效率相应提高200-300倍。CRISPR/Cas9系统是细菌在噬菌体长期选择压力下进化出来的一种有效抵御外源DNA入侵的免疫机制。在细菌细胞内,CRISPR簇在其前导区的调控下转录成precrRNA,然后在tracrRNA和Cas9参与下成为加工成熟的crRNA,并引导crRNA/tracrRNA/Cas9复合体识别结合外源DNA特定序列,剪切DNA双链,沉默外源基因的表达。基于此种原理,CRISPR/Cas9系统被开发成一种新型的基因打靶系统。CRISPR/Cas9系统由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合物,它对靶点的识别依赖于RNA对靶DNA序列的识别,识别作用通过碱基的互补配对完成。对一个具体的DNA位点进行基因打靶,只需要在原有gRNA核心序列的基础上添加21 bp长度的核苷酸序列作为引导序列即可,此引导序列的的3′端必须存在PAM序列(NGG)。因此,在gRNA核心序列上添加引导序列的构建过程极为简单和快捷。通过生物信息学分析,本研究组在水牛细胞的rRNA基因间的内部转录间隔序列中,确定了适合gRNA识别并结合Cas9进行切割的位点,并针对该位点,根据gRNA的序列特征,设计了3条gRNA序列,并构建同时表达gRNA和Cas9的真核表达载体。此外,在gRNA识别的靶位点的两侧设计和扩增两条基因打靶同源引导序列DS1和DS2,将DS1,DS2以及EGFP基因分别插入pUC19载体中,构建成多位点基因打靶载体pUC19-DS1-EGFP-DS2。利用多位点基因打靶载体结合gRNA和Cas9的表达载体,可以在水牛细胞中进行初步的CRISPR/Cas9诱导的多位点基因打靶研究,将有可能为水牛转基因研究提供高效定点转基因方法。(本文来源于《广东省遗传学会第九届代表大会暨学术研讨会论文及摘要汇编》期刊2014-12-19）
基因打靶载体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:构建基于细菌Ⅱ型内含子的Targetron基因打靶载体,并在大肠杆菌中验证其功能。方法:以构建的p SY7载体为基础、以大肠杆菌lac Z基因为例,选择lac Z-1683a和lac Z-1874s位点为靶位点,利用在线设计软件设计打靶引物,通过重迭延伸PCR方法获得特异性打靶序列,并将其克隆到p SY7载体,获得p SY7-lacZ-1683a和p SY7-lacZ-1874s打靶载体,转化大肠杆菌后利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导插入型内含子的表达,最后利用菌落PCR和蓝白斑计数法验证其功能及打靶效率。结果:成功构建了p SY7-lacZ-1683a和p SY7-lac Z-1874s两种Targetron打靶载体,通过0.5 mmol/L IPTG诱导45 min后,菌落PCR显示Ⅱ型内含子能特异性插入到lac Z-1683a、lac Z-1874s位点,蓝白斑计数显示lac Z-1683a位点的打靶效率为(14.299±1.271)%,lac Z-1874s位点的打靶效率为(9.217±1.024)%。结论:构建的Targetron打靶载体能够特异性的插入大肠杆菌染色体靶位点。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
基因打靶载体论文参考文献
[1].黄幸,严爱芬,邓廷贤,欧阳宏佳,刘连.锌指核酸酶介导的陆川猪Fat1基因打靶载体构建及体外转基因研究[J].农业生物技术学报.2019
[2].黄瑾,陈相好,吴晓娟,张峥嵘,谷俊莹.大肠杆菌Targetron基因打靶载体构建及应用[J].贵州医科大学学报.2019
[3].王智玮,龙中儿,江云,黄运红.炭样小单孢菌JXNU-1基因打靶载体的构建[J].基因组学与应用生物学.2019
[4].孙筱品,董玉梅,汪海燕,谌容,桂飞.Neuritin条件性基因打靶载体的构建和同源重组胚胎干细胞克隆鉴定[J].动物医学进展.2019
[5].刘晙玭,汪智琼,平光伦,石玉琴,张玲.利用新型DNDF7和携带LoxP位点的LPL4质粒快速构建S-Sox5基因打靶载体[J].中国男科学杂志.2015
[6].梁浩,刘慧,韩雪洁,赵宇航,塔娜.基础型无启动子基因打靶载体pMCS-IEN的构建及初步检测[J].农业生物技术学报.2015
[7].王越,金镇,孙磊,郑晋华.小鼠性激素结合球蛋白条件基因打靶载体的构建[J].中国医科大学学报.2015
[8].郭慧琴,苏少锋,任卫波,尹俊.绒山羊FGF5基因打靶载体的构建[J].生物技术.2015
[9].刘婉霞,严爱芬,刘芳,唐冬生.基于TALEN技术的多位点基因打靶载体构建和鉴定[C].广东省遗传学会第九届代表大会暨学术研讨会论文及摘要汇编.2014
[10].马小娅,蒋泓,刘芳,唐冬生.CRISPR/Cas9介导的水牛多位点基因打靶载体的构建[C].广东省遗传学会第九届代表大会暨学术研讨会论文及摘要汇编.2014
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