全文摘要
本发明公开了一种筒状蛋白纳米反应器在显色检测中的应用，以四甲基联苯二胺为发色底物，在筒状蛋白纳米反应器内，H2O2还原成H2O，四甲基联苯二胺被氧化为蓝色的二亚胺化合物，644nm处产生特征吸收峰；加入浓硫酸后，显色反应终止，通过450nm处的吸收峰进行定量分析；筒状蛋白纳米反应器主体为两端开口的筒状蛋白，并且筒状蛋白两端开口处内表面通过疏水作用结合具有催化活性的疏水客体；筒状蛋白的筒壁为多孔结构。将筒状蛋白纳米反应器应用于显色检测可通过纳米尺寸效应提高监测的灵敏度和准确率。
主设计要求
1.一种筒状蛋白纳米反应器在显色检测中的应用，其特征在于，以四甲基联苯二胺为发色底物，在筒状蛋白纳米反应器内，H2O2还原成H2O，四甲基联苯二胺被氧化为蓝色的二亚胺化合物，644nm处产生特征吸收峰；加入浓硫酸后，显色反应终止，通过450nm处的吸收峰进行定量分析；所述筒状蛋白纳米反应器主体为两端开口的筒状蛋白，并且筒状蛋白两端开口处内表面通过疏水作用结合具有催化活性的疏水客体；所述筒状蛋白的筒壁为多孔结构；显色检测具体步骤为：将20μM筒状蛋白纳米反应器溶液与3mM四甲基联苯二胺溶液等体积混合，静置10min，得到混合液；之后加入所述混合液一半体积的含H2O2的溶液，30℃水浴锅中孵育20min；孵育后加入体积分数20％的硫酸终止显色反应，利用紫外可见分光光度计测量450nm处的吸光度；以H2O2浓度为横坐标，450nm处的吸光度为纵坐标绘制标准曲线；检测未知溶液中H2O2含量时，测定450nm处的吸光度值，根据标准曲线即可推算出H2O2浓度；所述筒状蛋白纳米反应器内径4.5nm，外径14nm，高14.6nm；所述筒状蛋白纳米反应器的制备方法包括如下步骤：(1)以pET-28a+为载体将SEQIDNO:1所示基因转入大肠杆菌菌株C41(DE3)中，构建得到工程菌；对工程菌进行扩大培养，诱导筒状蛋白表达，提取纯化筒状蛋白；(2)将具有催化活性的疏水客体分散于含Tween80的氢氧化钠溶液中，得到疏水客体胶束母液；稀释疏水客体胶束母液，并与筒状蛋白溶液等体积混合，装入透析袋中，置于缓冲液中充分透析，得到筒状蛋白纳米反应器；所述步骤(1)具体为：合成SEQIDNO:1所示目的基因，通过NcoI和HindIII两个酶切位点连接到质粒pET-28a+中，通过热激法将含有目的基因的pET-28a+转入大肠杆菌C41(DE3)中；挑选转化成功的单克隆接种到LB培养基中进行扩大培养，当菌液OD600达到1.5-2.0时，加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，25℃下诱导C41(DE3)进行蛋白表达；诱导12-14小时后，离心收集菌体，在pH为7.5的50mMTris-HCl缓冲溶液中重新悬浮菌体，利用高压破碎仪对菌液进行破碎；破碎后离心取上清液，0.45μm滤膜过滤；收集过滤液，先后使用阴离子交换柱和凝胶色谱柱对蛋白进行纯化，最后得到纯度＆gt;95％的筒状蛋白；所述步骤(2)将1mM疏水客体分散于含1.5mMTween80的15mM氢氧化钠溶液中，得到疏水客体胶束母液；将疏水客体胶束母液用pH7.5的50mMTris-HCl缓冲溶液稀释至100μM，与1μM筒状蛋白溶液等体积混合，装入25kDa透析袋中，置于pH7.5的50mMTris-HCl缓冲溶液中透析48h，得到筒状蛋白纳米反应器；所述疏水客体为铁卟啉。
设计方案
1.一种筒状蛋白纳米反应器在显色检测中的应用，其特征在于，以四甲基联苯二胺为发色底物，在筒状蛋白纳米反应器内，H2<\/sub>O2<\/sub>还原成H2<\/sub>O，四甲基联苯二胺被氧化为蓝色的二亚胺化合物，644nm处产生特征吸收峰；加入浓硫酸后，显色反应终止，通过450nm处的吸收峰进行定量分析；
所述筒状蛋白纳米反应器主体为两端开口的筒状蛋白，并且筒状蛋白两端开口处内表面通过疏水作用结合具有催化活性的疏水客体；所述筒状蛋白的筒壁为多孔结构；
显色检测具体步骤为：
将20μM筒状蛋白纳米反应器溶液与3mM四甲基联苯二胺溶液等体积混合，静置10min，得到混合液；
之后加入所述混合液一半体积的含H2<\/sub>O2<\/sub>的溶液，30℃水浴锅中孵育20min；
孵育后加入体积分数20％的硫酸终止显色反应，利用紫外可见分光光度计测量450nm处的吸光度；以H2<\/sub>O2<\/sub>浓度为横坐标，450nm处的吸光度为纵坐标绘制标准曲线；
检测未知溶液中H2<\/sub>O2<\/sub>含量时，测定450nm处的吸光度值，根据标准曲线即可推算出H2<\/sub>O2<\/sub>浓度；
所述筒状蛋白纳米反应器内径4.5nm，外径14nm，高14.6nm；
所述筒状蛋白纳米反应器的制备方法包括如下步骤：
(1)以pET-28a+为载体将SEQ ID NO:1所示基因转入大肠杆菌菌株C41(DE3)中，构建得到工程菌；对工程菌进行扩大培养，诱导筒状蛋白表达，提取纯化筒状蛋白；
(2)将具有催化活性的疏水客体分散于含Tween80的氢氧化钠溶液中，得到疏水客体胶束母液；稀释疏水客体胶束母液，并与筒状蛋白溶液等体积混合，装入透析袋中，置于缓冲液中充分透析，得到筒状蛋白纳米反应器；
所述步骤(1)具体为：
合成SEQ ID NO:1所示目的基因，通过NcoI和HindIII两个酶切位点连接到质粒pET-28a+中，通过热激法将含有目的基因的pET-28a+转入大肠杆菌C41(DE3)中；
挑选转化成功的单克隆接种到LB培养基中进行扩大培养，当菌液OD600<\/sub>达到1.5-2.0时，加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，25℃下诱导C41(DE3)进行蛋白表达；
诱导12-14小时后，离心收集菌体，在pH为7.5的50mM Tris-HCl缓冲溶液中重新悬浮菌体，利用高压破碎仪对菌液进行破碎；破碎后离心取上清液，0.45μm滤膜过滤；收集过滤液，先后使用阴离子交换柱和凝胶色谱柱对蛋白进行纯化，最后得到纯度>95％的筒状蛋白；
所述步骤(2)将1mM疏水客体分散于含1.5mM Tween80的15mM氢氧化钠溶液中，得到疏水客体胶束母液；将疏水客体胶束母液用pH7.5的50mM Tris-HCl缓冲溶液稀释至100μM，与1μM筒状蛋白溶液等体积混合，装入25kDa透析袋中，置于pH7.5的50mM Tris-HCl缓冲溶液中透析48h，得到筒状蛋白纳米反应器；
所述疏水客体为铁卟啉。
设计说明书
技术领域
本发明涉及生物纳米技术领域，更具体的说是涉及一种筒状蛋白纳米反应器在显色检测中的应用。
背景技术
常见的纳米反应器大体可以分为四大类，即反相微乳液、嵌段共聚物、多孔材料和层状盐酸盐。但人工合成纳米结构的精致性、均一性和单分散性均无法与基于蛋白笼的蛋白纳米反应器相比较。
利用成熟的分子生物学技术，人们可以方便地克隆出纳米蛋白笼组成单元的基因，并且可以利用异源表达体系大量合成出重组蛋白纳米笼，进而为其应用提供基础。
目前，显色检测是一种广泛应用的检测方法，其简便、快捷、准确、检测限低、灵敏度高。而纳米反应器会产生纳米尺寸效应，显著提高反应速率。因此，如何将蛋白笼构筑的单分散性纳米反应器应用于显色检测中、结合敏感的色原底物提高检测灵敏度和准确性成为本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种筒状蛋白纳米反应器在显色检测中的应用，实现了高灵敏度、高准确率的检测。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种筒状蛋白纳米反应器在显色检测中的应用，以四甲基联苯二胺为发色底物，在筒状蛋白纳米反应器内，H2<\/sub>O2<\/sub>还原成H2<\/sub>O，四甲基联苯二胺被氧化为蓝色的二亚胺化合物，644nm处产生特征吸收峰；加入浓硫酸后，显色反应终止，通过450nm处的吸收峰进行定量分析；
筒状蛋白纳米反应器主体为两端开口的筒状蛋白，并且筒状蛋白两端开口处内表面通过疏水作用结合具有催化活性的疏水客体；筒状蛋白的筒壁为多孔结构。
以四甲基联苯二胺为发色底物可配制成液体试剂储存，使用安全方便，且具有较高的检测敏感性。
筒状蛋白两端开口，筒壁为多孔结构，底物分子既可从两端进入筒状蛋白的空腔进行反应，又可穿过筒壁进入空腔；该结构同样有利于产物的释放。
优选地，显色检测具体步骤为：
将20μM筒状蛋白纳米反应器溶液与3mM四甲基联苯二胺溶液等体积混合，静置10min，得到混合液；
之后加入混合液一半体积的含H2<\/sub>O2<\/sub>的溶液，30℃水浴锅中孵育20min；
孵育后加入体积分数20％的硫酸终止显色反应，利用紫外可见分光光度计测量450nm处的吸光度；以H2<\/sub>O2<\/sub>浓度为横坐标，450nm处的吸光度为纵坐标绘制标准曲线；
检测未知溶液中H2<\/sub>O2<\/sub>含量时，测定450nm处的吸光度值，根据标准曲线即可推算出H2<\/sub>O2<\/sub>浓度。
优选地，筒状蛋白纳米反应器内径4.5nm，外径14nm，高14.6nm。
优选地，筒状蛋白纳米反应器的制备方法包括如下步骤：
(1)以pET-28a+为载体将SEQ ID NO:1所示基因转入大肠杆菌菌株C41(DE3)中，构建得到工程菌；对工程菌进行扩大培养，诱导筒状蛋白表达，提取纯化筒状蛋白；
(2)将具有催化活性的疏水客体分散于含Tween 80的氢氧化钠溶液中，得到疏水客体胶束母液；稀释疏水客体胶束母液，并与筒状蛋白溶液等体积混合，装入透析袋中，置于缓冲液中充分透析，得到筒状蛋白纳米反应器。
优选地，步骤(1)具体为：
合成SEQ ID NO:1所示目的基因，通过NcoI和HindIII两个酶切位点连接到质粒pET-28a+中，通过热激法将含有目的基因的pET-28a+转入大肠杆菌C41(DE3)中；
挑选转化成功的单克隆接种到LB培养基中进行扩大培养，当菌液OD600<\/sub>达到1.5-2.0时，加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，25℃下诱导C41(DE3)进行蛋白表达；
诱导12-14小时后，离心收集菌体，在pH为7.5的50mM Tris-HCl缓冲溶液中重新悬浮菌体，利用高压破碎仪对菌液进行破碎；破碎后离心取上清液，0.45μm滤膜过滤；收集过滤液，先后使用阴离子交换柱和凝胶色谱柱对蛋白进行纯化，最后得到纯度>95％的筒状蛋白。
优选地，步骤(2)将1mM疏水客体分散于含1.5mM Tween 80的15mM氢氧化钠溶液中，得到疏水客体胶束母液；将疏水客体胶束母液用pH 7.5的50mM Tris-HCl缓冲溶液稀释至100μM，与1μM筒状蛋白溶液等体积混合，装入25kDa透析袋中，置于pH 7.5的50mM Tris-HCl缓冲溶液中透析48h，得到筒状蛋白纳米反应器。
进一步地，在筒状蛋白纳米反应器溶液中加入腺苷三磷酸分子ATP，可以实现筒状蛋白与疏水客体的分离，进而实现筒状蛋白的回收和循环利用。
优选地，疏水客体为铁卟啉。
由上述技术方案可知，本发明将化学反应限制在纳米级空间，为反应提供了一个高效集约的平台。筒状蛋白筒壁上有大量孔状结构，小分子化合物可以自由穿越，有利于反应物的进入和产物的释放。筒状蛋白两端开口处内表面能够与具有催化活性的疏水客体小分子自发结合，从而组合构建成特异性的纳米反应器。将其用于显色检测灵敏度高、准确率高，适于推广应用。
附图说明
图1所示为利用SDS-PAGE对纯化的筒状蛋白样品进行纯度分析，并与表达菌体破碎液进行对比；纯化样品泳道中箭头指示为筒状蛋白单体对应条带(57kDa)，十四个单体自发聚集形成多孔的800kDa纳米筒状结构。
图2所示为筒状蛋白纳米反应器设计及催化显色检测原理。
图3所示为利用紫外可见分光光度计检测四甲基联苯二胺被氧化时的显色过程。
图4所示为用筒状蛋白纳米反应器和四甲基联苯二胺检测H2<\/sub>O2<\/sub>的剂量-反应曲线；误差棒代表三次检测的标准偏差。
图5所示为通过荧光各向异性变化展示ATP诱导的筒状蛋白与疏水客体的分离。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1筒状蛋白的制备
商业合成目的基因如SEQ ID NO:1所示，通过NcoI和HindIII两个酶切位点连接到质粒pET-28a+中，通过热激法将含有目的基因的pET-28a+转入大肠杆菌C41(DE3)中。
将转化混合液均匀涂抹在含卡那霉素(100μg\/ml)的LB固体培养基上，放入37℃恒温培养箱过夜培养(14-16小时)；挑选过夜生长出来的单克隆，进行目的基因的测序验证；将测序正确的单克隆接种到LB培养基中进行扩大培养，当菌液OD600<\/sub>达到1.5-2.0时，加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，25℃下诱导C41(DE3)进行蛋白表达。
诱导12-14小时后，离心收集菌体(转速5000g)，然后在50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH为7.5)中重新悬浮菌体，利用高压破碎仪对菌液进行破碎；破碎后再离心(转速8000g)，取上清液，用0.45μm的滤膜过滤，进一步除去不溶物；收集过滤液，首先上样到阴离子交换柱(HiTrap Q FF)中，用0-1M的NaCl线性梯度洗脱，收集500mM附近出现的峰组分，用AmiconUltra-5浓缩管进行样品浓缩后，上样到凝胶色谱柱(Sephadex G)中，用50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH为7.5)洗脱，收集第一个峰组分，再用浓缩管进行蛋白浓缩(使用时用pH7.5的50mM Tris-HCl缓冲溶液稀释)；采用SDS-PAGE蛋白电泳对蛋白纯度进行表征，最后得到纯度>95％的筒状蛋白，如图1所示。
实施例2筒状蛋白纳米反应器的制备
将铁卟啉分散到含1.5mM Tween 80的15mM氢氧化钠溶液中，得到1mM铁卟啉胶束母液；将铁卟啉胶束母液用pH7.5的50mM Tris-HCl缓冲溶液稀释至100μM，与1μM筒状蛋白溶液等体积混合，装入25kDa透析袋中，置于pH7.5的50mM Tris-HCl缓冲溶液透析48小时，得到筒状蛋白纳米反应器；对筒状蛋白纳米反应器中铁卟啉进行定量，使用时将铁卟啉浓度固定为20μM。
对筒状蛋白纳米反应器中铁卟啉进行定量时，首先确定封装在其中的铁卟啉的摩尔消光系数，具体方法为：设置封装到蛋白纳米反应器中不同浓度的铁卟啉溶液，测得其396nm处的UV-vis吸光度，然后绘制不同铁卟啉浓度-吸光度标准曲线，拟合求得蛋白纳米反应器中铁卟啉的摩尔消光系数为5.2×104<\/sup>M-1<\/sup>·cm-1<\/sup>。基于此系数，利用UV-vis测定未知浓度样品的吸光度后，可以计算其中铁卟啉的浓度。
如图2所示，筒状蛋白纳米反应器包括两端开口的筒状蛋白，筒状蛋白具有一中央空腔，筒状蛋白内径4.5nm，外径14nm，高14.6nm，筒状蛋白的筒壁为多孔结构。筒状蛋白两端开口处内表面通过疏水作用结合具有催化活性的铁卟啉。
实施例3筒状蛋白纳米反应器在显色检测中的应用
将3mM四甲基联苯二胺溶液和20μM筒状蛋白纳米反应器溶液等体积混合，静置10分钟，之后加入混合液一半体积的0-900μM H 2<\/sub>O2<\/sub>溶液，置于30℃水浴锅中孵育20分钟；如图3所示，随着时间的推移进行，反应体系在644nm处的吸收强度逐渐增加，反应呈现的蓝色也不断加深。
孵育后加入硫酸(20％，v\/v)以终止显色反应；利用紫外可见分光光度计测量其在450nm处的吸光度；以H2<\/sub>O2<\/sub>浓度为横坐标，450nm处的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。如图4所示，加入不同浓度的过氧化氢之后，筒状蛋白纳米反应器具有很好的灵敏度，说明其对H2<\/sub>O2<\/sub>氧化四甲基联苯二胺反应有很好的催化效果，可用于H2<\/sub>O2<\/sub>的显色检测。随着H2<\/sub>O2<\/sub>浓度的增加，450nm处吸光度增加，在0-300μM H 2<\/sub>O2<\/sub>的浓度范围内，两个变量之间呈现良好的线性关系，计算得到H2<\/sub>O2<\/sub>的检测极限在2μM左右。
检测未知溶液中H2<\/sub>O2<\/sub>含量时，按上述方法测定450nm处的吸光度值，通过在标准曲线中插值即可推算出待测溶液中H2<\/sub>O2<\/sub>浓度。
实施例4ATP诱导的筒状蛋白与疏水客体的分离
ATP能与筒状蛋白结合，使筒状蛋白末端开口处疏水区域发生构象改变，从而促使原来结合的疏水客体从筒状蛋白上脱离。基于铁卟啉的自发荧光，利用荧光各向异性技术，可以直观地展示该过程。荧光各向异性表征的基本原理为：在使用同一种溶剂的情况下，转动分子越大，转动扩散的速度越小，所测得的荧光各向异性值也就越大；反之，转动分子越小，转动扩散的速度越大，所测得的荧光各向异性值就会越小。将5μM的铁卟啉溶液与0.2μM的筒状蛋白溶液等体积混合后，体系的荧光各向异性骤升并迅速达到稳态值，如图5所示，这表明两者快速结合并形成稳定的纳米反应器复合体；加入ATP(终浓度1mM)以后，荧光各向异性陡降，反映了筒状蛋白与疏水客体的有效分离。因此，显色检测后加入ATP，可实现筒状蛋白的回收和循环利用。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 青岛古高生物科技有限公司
<120> 一种筒状蛋白纳米反应器在显色检测中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1644
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
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设计图
相关信息详情
申请码:申请号:CN201910020249.1
申请日:2019-01-09
公开号:CN109724969A
公开日:2019-05-07
国家:CN
国家/省市:95(青岛)
授权编号:CN109724969B
授权时间:20190906
主分类号:G01N 21/78
专利分类号:G01N21/78;G01N21/31
范畴分类:31E;
申请人:青岛古高生物科技有限公司
第一申请人:青岛古高生物科技有限公司
申请人地址:266000 山东省青岛市高新区河东路368号蓝色生物医药产业园6号楼1层101.102室
发明人:王小强;杨伟娟;张辉
第一发明人:王小强
当前权利人:青岛古高生物科技有限公司
代理人:李冉
代理机构:11465
代理机构编号:北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
优先权:关键词:当前状态:审核中
类型名称:外观设计