基于CRISPR/Cas9技术的HaCaT的TLR4基因定向敲除及其功能初步研究

论文摘要

[目的]构建敲除Toll Like Receptor 4（TLR4）基因的Ha Ca T细胞株,为后续利用该细胞株进行过敏原性研究提供材料。[方法]利用CRISPR/Cas9系统,根据靶向原理设计并合成4条特异性识别TLR4基因的向导RNA（single-molecule guide RNAs,sgRNAs）,构建p X459-sgRNAh TLR4重组质粒,并转入Ha Ca T中,用嘌呤霉素筛选出单克隆阳性细胞。测序确认突变位点,然后利用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激对TLR4进行功能验证来进一步确认敲除效果。[结果]测序结果表明#26单克隆细胞株在靶点附近缺失1 bp,造成TLR4编码基因的移码突变,蛋白翻译提前终止。功能性验证结果表明,在LPS的刺激下,IL-8和CCL20的mRNA水平分别下降约85%和90%,且IL-8的蛋白分泌水平也显著性下调（87%）。[结论]成功构建了敲除TLR4的稳定细胞株,并且验证TLR4的功能缺损。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 实验材料
•     1.2.2试剂
•     1.2.3仪器
•   1.2 方法
•     1.2.1 人类TLR4基因结构分析及靶点设计
•     1.2.2 pX459-sgRNAhTLR4重组质粒构建及克隆
•     1.2.3 p X459-sgRNAhTLR4重组质粒转染、靶点效率检测及酶切验证
•     1.2.4 TLR4基因敲除的HaCaT细胞株的单克隆筛选
•     1.2.5 检测TLR4敲除的细胞株对LPS的应答
•     1.2.6 统计学分析
• 2 结果与分析
•   2.1 sgRNA靶点的选择及寡核苷酸链设计
•   2.2 利用CRISPR/Cas9系统打靶的重组载体构建
•   2.3 打靶效率的检测及酶切验证
•   2.4 敲除TLR4基因稳定的HaCaT细胞株的鉴定
•   2.5 TLR4稳定敲除株对LPS的应答
• 3 讨论
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 黄瑜烨,李碧舟,何颖,孟繁梅,邹泽红,陶爱林,艾云灿

关键词: 系统,基因,基因敲除,细胞株

来源: 生物技术 2019年01期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中山大学生命科学学院有害生物控制与资源利用国家重点实验室,广州医科大学附属第二医院/广东省过敏反应与免疫重点实验室/变态反应国家临床专科

基金: 国家科技重大专项(2016ZX08011-005,2014ZX08011-05B),广州市过敏反应临床医学研究与转化中心建设项目(201604020008)

分类号: Q78

DOI: 10.16519/j.cnki.1004-311x.2019.01.0011

页码: 57-62+102

总页数: 7

文件大小: 3212K

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