CRISPR/Cas9介导皮肤致敏评价细胞模型EndoSens的建立与评估研究

论文摘要

皮肤致敏性测试是化妆品原料和产品安全性评价的重要内容。随着国际社会对实验动物福利伦理和3R原则日益重视和不断推行,以及欧盟等国家相继对化妆品成分和产品禁止动物试验后,化妆品安全性评价体外替代方法研究成为国际发展趋势和研究热点。基于皮肤致敏有害结局通路的关键事件,开发模拟体内致敏过程的模型,是目前国内外体外替代方法研发的基本策略。在致敏物角质细胞激活水平,基于Keap1-Nrf2抗氧化反应元件（Antioxidant Response Element,ARE）荧光素酶报告模型(KeratinoSensTM和LuSens)均能在体外反映化合物皮肤致敏特性。但以上细胞模型均为随机插入的转基因荧光素酶报告细胞模型,实为间接评估皮肤致敏基因的表达,大量基因拷贝的转入也影响致敏评估结果的准确性。随着CRISPR/Cas9介导精准基因编辑技术的发展,可将荧光素酶报告基因定点整合到内源靶基因表达框内,达到真正实时同步报告内源靶基因的表达,从而更加准确地检测细胞致敏的表型。本研究应用CRISPR/Cas9和同源重组介导的精准基因编辑技术,成功建立了荧光素酶基因敲入的HMOX1实时报告角质细胞模型EndoSens。使用了35种化合物对EndoSens进行了皮肤致敏预测能力评价,其中包括OECD指导原则推荐的20种标准参考化合物。结果显示,EndoSens的准确性达90.0%,灵敏度达91.7%,特异性达87.5%,以上皮肤致敏的三项指标均超过了OECD指南的测试方法要求。通过35个测试化合物的数据比较,EndoSens的皮肤致敏预测能力同样高于已通过OECD验证的KeratinoSensTM细胞模型。同时,EndoSens也准确预测了中药取物化妆品成分的致敏性。EndoSens皮肤致敏预测细胞模型不仅可以实现对单一化合物的准确预测,还可以对复杂成分的化妆品中药植物取物进行皮肤致敏性评价。作为国内首个皮肤致敏体外替代细胞模型,也将进一步促进国内化妆品皮肤致敏体外替代与国际接轨。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 皮肤致敏及有害结局通路
•     1.1.1 皮肤致敏
•     1.1.2 皮肤致敏AOP
•   1.2 皮肤致敏评价方法研究现状
•     1.2.1 动物试验方法
•     1.2.2 体外替代试验方法
•     1.2.3 整合测试和评估方法
•   1.3 化妆品非动物测试法规现状
•     1.3.1 欧盟
•     1.3.2 加拿大
•     1.3.3 美国
•     1.3.4 巴西
•     1.3.5 日本
•     1.3.6 韩国
•     1.3.7 中国
•   1.4 CRISPR/Cas基因编辑技术研究现状
•     1.4.1 CRISPR/Cas系统的起源
•     1.4.2 CRISPR/Cas系统的作用机制
•     1.4.3 CRISPR/Cas系统的分类
•     1.4.4 CRISPR/Cas9 基因编辑技术及其应用
•   1.5 报告基因功能研究现状
•     1.5.1 内源报告系统中报告基因的研究现状
•     1.5.2 内源报告策略的研究现状
•     1.5.3 内源基因定点插入共表达研究现状
•   1.6 课题思路
•     1.6.1 研究目的和意义
•     1.6.2 研究内容
•     1.6.3 实施方案
• 第二章 利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术介导皮肤致敏细胞模型EndoSens的建立
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 主要仪器设备
•     2.2.2 主要试剂与耗材
•     2.2.3 菌株、细胞株及质粒
•     2.2.4 相关溶液和试剂配制
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 靶点特异性sgRNA设计与表达载体构建
•     2.3.2 荧光素酶基因敲入同源重组载体构建
•     2.3.3 质粒取
•     2.3.4 细胞培养
•     2.3.5 sgRNA剪切活性检测
•     2.3.6 基因敲入细胞系的筛选与鉴定
•     2.3.7 荧光素酶报告基因的表达验证
•   2.4 实验结果
•     2.4.1 U6-sgRNA重组表达载体构建
•     2.4.2 靶向HMOX1 基因同源重组载体构建
•     2.4.3 sgRNA的剪切活性检测
•     2.4.4 HMOX1 基因定点敲入细胞系鉴定
•     2.4.5 荧光素酶活性检测
•   2.5 讨论与小结
• 第三章 细胞模型EndoSens的皮肤致敏预测能力评估与比较
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 细胞来源
•     3.2.2 相关溶液和试剂配制
•     3.2.3 材料与试剂
•     3.2.4 主要仪器与设备
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 细胞培养及质控
•     3.3.2 测试化合物筛选
•     3.3.3 细胞毒性试验
•     3.3.4 荧光素酶活性检测
•     3.3.5 预测模型
•     3.3.6 统计学分析
•   3.4 实验结果
•     3.4.1 EndoSens细胞培养情况
•     3.4.2 测试化合物
•     3.4.3 细胞毒性检测
•     3.4.4 20种标准化学物的判定结果
•     3.4.5 15种测试化合物的判定结果
•     3.4.6 预测能力评估
•     3.4.7 模型比较
•   3.5 讨论与小结
• 第四章 基于细胞模型EndoSens的植物取物成分皮肤致敏风险评估
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 细胞来源
•     4.2.2 主要试剂与耗材
•     4.2.3 主要仪器设备
•     4.2.4 相关溶液和试剂配制
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 细胞培养
•     4.3.2 细胞毒性测定
•     4.3.3 荧光素酶活性检测
•     4.3.4 致敏性结果判定
•     4.3.5 统计分析
•   4.4 实验结果
•     4.4.1 植物取物筛选
•     4.4.2 植物取物的细胞毒性
•     4.4.3 阳性参照物的预测结果
•     4.4.4 植物取物皮肤致敏性预测结果
•   4.5 讨论与小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 攻读博士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件

文章来源

类型: 博士论文

作者: 钟国瑞

导师: 戴仁科

关键词: 皮肤致敏,非动物替代实验方法,有害结局通路,基因编辑技术

来源: 华南理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,皮肤病与性病

单位: 华南理工大学

分类号: Q78;R758.2

DOI: 10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.000220

总页数: 148

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