BmNPV编码的circRNA的功能及下调m~6A相关基因的表达对病毒增殖的影响

论文摘要

随着高通量技术的发展,越来越多的circRNA被发现并鉴定,并且被证明具有与miRNA和蛋白质结合、调控基因转录、翻译蛋白白等功能,在细胞增殖分化、生长发育、疾病发生和发展等过程中发挥重要作用。m6A修饰作为一种最普遍的甲基化修饰方式,近年来,已发现m6A可以参与调控病毒增殖复制。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori Nucleopolyheadrovirus,BmNPV）引起的家蚕血液型脓病给养蚕业带来巨大的损失,至今还没有关于BmNPV转录产物形成circRNA以及m6A修饰对BmNPV增殖复制调控的报道。本研究通过circRNAs高通量技术比较了BmNPV感染后的中肠和正常中肠中家蚕circ RNAs表达,共发现353个circRNAs的表达存在显著差异,相比较于正常中肠,在感染BmNPV的中肠中241个circRNA表达上调,1 12个circRNA表达下调。GO和KEGG的分析显示,家蚕来源的circRNA可能通过与miRNA互作参与调控细胞凋亡、内吞作用和泛素化等过程。进一步将BmNPV感染家蚕的中肠circRNA高通量测序数据与BmNPV基因组比对,发现了 BmNPV来源的circRNA。基于发散型引物PCR和Sanger测序,鉴定到 3 种 BmNPV 来源的 circRNA,命名为 circ003、circ004、circ010。定量PCR检测结果表明,在BmNPV感染12h后,circ003开始表达,并逐渐积累,其亲本基因lef-6在感染6h后开始表达,circ003能以剂量依赖方式抑制BmNPV增殖,促进家蚕培养细胞BmN从G1期进入S期。circ004在BmNPV感染12h后开始产生,其亲本基因odv-e66的表达也能在同时期检测到,上调circ004的表达水平可激活家蚕先天免疫相关基因Dicer2的表达。circ010在BmNPV感染6h后产生,其亲本基因odv-e18表达也能同时检测到。细胞免疫荧光结果显示,这3种circRNA 均可与 NF90/NF110、Rig-1共定位。circRNA-pull down 结果显示,circ010有可能通过与蛋白互作发挥功能。这些结果表明BmNPV可表达功能性circRNAs,对调节病毒的感染进程、在病毒与宿主的互作中发挥作用。m6A修饰对BmNPV增殖的影响还不明。通过RNAi降低与m6A有关的METTETL3、MTL14、YTHDF3基因的表达水平,发现其对BmNPV的Bm59基因的表达下调,而Western blot的结果显示,METTL3表达下调导致odv-e25蛋白水平上升,YTHDF3表达下调引起odv-e25蛋白水平下调,推测细胞甲基化水平的影响病毒的增殖。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
•   1 环状RNA（circular RNA）的研究进展
•     1.1 circRNA的特点
•     1.2 circRNA的类型
•     1.3 circRNA的形成方式
•     1.4 circRNA的功能
•     1.5 circRNA表达对病毒的感染应答及病毒编码的circRNA
•   2 BmNPV的研究进展
•     2.1 BmNPV生活史
•     2.2 BmNPV基因组结构及其基因表达模式
•     2.3 宿主对BmNPV感染的应答
•     2.4 BmNPV有关miRNA的研究
• 6-methyladenosine（m⁶A）修饰相关研究进展'>  3 N⁶-methyladenosine（m⁶A）修饰相关研究进展
•   4 研究目的和内容
•     4.1 研究目的与意义
•     4.2 研究的主要内容
•     4.3 技术路线
•   参考文献
• 第二章 家蚕中肠circRNA表达模式对BmNPV的感染应答
•   1 引言
•   2 材料与方法
•     2.1 实验材料
•     2.2 试剂配制
•     2.3 实验方法
•   3 结果与分析
•     3.1 BmNPV感染后家蚕来源circRNA的表达情况分析
•     3.2 家蚕circRNA的鉴定
•     3.3 BmNPV感染后差异表达的circRNA
•     3.4 定量PCR验证circRNA表达水平
•     3.5 差异表达的circRNA的功能分析
•     3.6 靶miRNA的预测
•     3.7 circRNA-miRNA网络图的构建
•     3.8 富集程度最高的miRNA的靶mRNA预测
•     3.9 miRNA的靶mRNA的GO和KEGG分析
•     3.10 circRNA-miRNA-mRNA网络图的构建
•   4 讨论
•   参考文献
• 第三章 BmNPV编码的cricRNA的功能研究
•   1 引言
•   2 材料与方法
•     2.1 实验材料
•     2.2 试剂配制
•     2.3 实验方法
•   3 结果与分析
•     3.1 BmNPV来源的circRNA的鉴定
•     3.2 BmNPV编码的circRNA-家蚕miRNA-家蚕mRNA网络的构建
•     3.3 circRNA表达载体pIZT-LcR-003的构建验证
•     3.4 家蚕NF90/NF110的原核表达及多克隆抗体的制备
• circ₀03的功能研究'>    3.5 BmNPV_circ₀03的功能研究
• circ₀04的功能研究'>    3.6 BmNPV_circ₀04的功能研究
• circ₀10的功能研究'>    3.7 BmNPV_circ₀10的功能研究
•   4 讨论
•   参考文献
• 第四章 降低RNA甲基化相关酶基因的表达对BmNPV增殖的影响
•   1 引言
•   2 材料与方法
•     2.1 实验材料
•     2.2 试剂配制
•     2.3 实验方法
•   3 结果与分析
•     3.1 转染siRNA有效降低目的基因的表达水平
•     3.2 转染siRNA对BmNPV-Bm59基因表达水平的影响
•     3.3 转染siRNA对BmNPV-odv-e25表达水平的影响
•   4 讨论
•   参考文献
• 结论
•   1 已取得的成果
•   2 有待进行的研究
• 附件
•   一、缩略词表
•   二、实验所用载体图谱
•   三、实验使用主要仪器
•   四、实验原始数据
• 在校期间发表论文情况
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 蒋梦生

导师: 曹广力,贡成良

关键词: 家蚕

来源: 苏州大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 苏州大学

分类号: Q933

DOI: 10.27351/d.cnki.gszhu.2019.002994

总页数: 133

文件大小: 9457K

下载量: 30