番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）Cd胁迫应答基因SlPLA2α的筛选与功能鉴定

论文摘要

随着人类的频繁活动及工厂污染物的排放,重金属污染问题日趋严重。镉（Cd）作为一种毒性极强的重金属广泛存在于自然环境中,它能够溶解于水体中,也能长时间残留于土壤中,并且不能被生物体降解,因而当植物吸收镉后,会通过食物链的积累,毒害动物及人体。番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）属于茄科（Solanaceae）植物,因其果实可以鲜食或加工而在各个国家和地区广泛种植,是重要的世界性蔬菜作物之一。番茄受重金属毒害后主要表现为植株矮小、发育缓慢、叶片黄化卷曲等。磷脂酶A2（PLA2）是一类能够催化水解磷脂质的酶,在细胞感受外界刺激及其信号传导过程中起着重要作用。目前,与动物中的研究相比,PLA2在植物中的研究报道相对较少,所以研究其具体的作用机制已成为近年来植物分子生物学中发展最迅速的领域之一。本试验以番茄磷脂酶基因SlPLA2α为研究对象,对该基因的表达模式和功能进行了分析,旨在为探究SlPLA2α基因参与番茄响应Cd胁迫应答的分子机制提供一定理论基础。本试验结果表明:（1）克隆获得SlPLA2α基因CDS区全长后,进一步通过生物信息学分析对SlPLA2α基因编码蛋白质的结构和功能进行预测分析。结果表明,该序列开放阅读框所翻译的蛋白质有156个氨基酸,主要由α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲及延伸链组成,推测该蛋白为非可溶性膜外蛋白,存在信号肽,具有苏氨酸磷酸化位点,启动子顺势作用元件预测分析表明该基因可能参与逆境胁迫反应。（2）利用实时荧光定量PCR技术,对SlPLA2α基因在番茄不同组织器官的表达特性及在不同处理条件下根和叶中的表达模式进行分析。结果表明,SlPLA2α基因在番茄不同组织中表达量差异显著;在不同处理下,SlPLA2α基因对CdCl2及2,4-表油菜素内酯（EBR）处理均能做出应答反应,并且随着处理条件的不同表达模式也发生变化。（3）将SlPLA2α基因构建到酵母表达载体PYES2上,转化酵母INVSC1感受态细胞中,比较非重组酵母及重组酵母在不同浓度CdCl2（5、10、15、20、25μmol/L）胁迫下的生存情况。结果表明SlPLA2α基因显著提高了酵母对CdCl2的耐受性。（4）将SlPLA2α基因构建到植物表达载体pCAMBIA2300上,运用根癌农杆菌介导的花序浸润法进行拟南芥遗传转化,获得6株PCR阳性植株,进一步通过RT-PCR鉴定技术表明该基因已在植株转录水平表达。对3个过表达SlPLA2α基因的拟南芥株系进行不同浓度的CdCl2（25、50、75μmol/L）胁迫处理,比较各株系的发芽率,从而分析转基因拟南芥耐Cd胁迫能力。结果表明,在不同浓度CdCl2胁迫下,3个转基因拟南芥株系的发芽率均高于野生型,且#4株系最为显著,说明转SlPLA2α基因拟南芥在种子萌发期提高了对Cd胁迫的耐受性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 重金属对植物生长发育的影响
•     1.1.1 植物对重金属的吸收
•     1.1.2 重金属对植物的氧化损伤
•   1.2 植物耐重金属胁迫的机制研究
•     1.2.1 根系分泌物及植物螯合肽（PCs）对重金属胁迫的缓解作用
•     1.2.2 脯氨酸（Pro）及抗氧化系统对重金属胁迫的缓解作用
•   1.3 油菜素内酯（EBR）在植物重金属胁迫响应中的作用
• 2（PLA₂）的研究进展'>  1.4 磷脂酶A₂（PLA₂）的研究进展
•   1.5 研究目的意义与技术路线
•     1.5.1 研究目的意义
•     1.5.2 研究技术路线
• 2基因的克隆及生物信息学分析'>第2章 番茄PLA₂基因的克隆及生物信息学分析
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 材料
•     2.1.2 方法
•   2.2 结果
•     2.2.1 番茄总RNA检测结果
• 2α基因CDS区的获得'>    2.2.2 SlPLA₂α基因CDS区的获得
•     2.2.3 菌液PCR扩增及质粒双酶切鉴定
• 2α基因的生物信息学分析'>    2.2.4 SlPLA₂α基因的生物信息学分析
•   2.3 讨论
•   2.4 小结
• 2α基因的表达模式分析'>第3章 Cd胁迫下番茄SlPLA₂α基因的表达模式分析
•   3.1 试验材料及试剂
•     3.1.1 试验材料
•     3.1.2 主要试验仪器
•     3.1.3 试剂、酶和引物
•   3.2 方法
•     3.2.1 组织表达番茄各组织器官的取材
•     3.2.2 EBR及Cd处理的取材
•     3.2.3 RNA提取及检测
•     3.2.4 cDNA获得
• 2α基因的表达模式分析'>    3.2.5 番茄不同组织器官及Cd胁迫下SlPLA₂α基因的表达模式分析
•   3.3 结果
•     3.3.1 番茄各组织器官总RNA提取结果
• 2α基因在番茄不同组织器官中的表达分析'>    3.3.2 SlPLA₂α基因在番茄不同组织器官中的表达分析
• 2α基因的表达模式分析'>    3.3.3 不同浓度Cd处理下番茄SlPLA₂α基因的表达模式分析
• 2α基因的表达模式分析'>    3.3.4 不同时间Cd处理下番茄SlPLA₂α基因的表达模式分析
•   3.4 讨论
•   3.5 小结
• 2α基因在酿酒酵母中功能鉴定'>第4章 SlPLA₂α基因在酿酒酵母中功能鉴定
•   4.1 实验材料与试剂
•     4.1.1 菌种和质粒
•     4.1.2 主要试剂
•   4.2 试验方法
•     4.2.1 酵母表达载体的构建
•     4.2.2 重组质粒和PYES2质粒的酵母转化及鉴定
•     4.2.3 重组酵母的逆境胁迫试验
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 表达载体及酵母重组子获得
•     4.3.2 不同浓度Cd胁迫下重组酵母的抗性分析
•   4.4 讨论
•   4.5 小结
• 2α基因拟南芥在Cd胁迫下的功能分析'>第5章 过表达SlPLA₂α基因拟南芥在Cd胁迫下的功能分析
•   5.1 试验材料
•     5.1.1 植物材料
•     5.1.2 菌种与载体
•     5.1.3 主要试剂
•     5.1.4 培养基
•   5.2 试验方法
•     5.2.1 植物表达载体的构建
•     5.2.2 重组载体双酶切鉴定
•     5.2.3 农杆菌介导的拟南芥遗传转化
•     5.2.4 拟南芥种子的收取与筛选
•     5.2.5 转基因拟南芥的DNA鉴定
•     5.2.6 转基因拟南芥的RNA鉴定
•     5.2.7 转基因拟南芥种子的收取与保存
•     5.2.8 转基因拟南芥在种子萌发期的表型分析
•   5.3 结果与分析
•     5.3.1 植物表达载体双酶切鉴定
•     5.3.2 卡那抗性植株的筛选
•     5.3.3 转基因拟南芥的DNA鉴定
•     5.3.4 转基因拟南芥的RNA鉴定
• 2α基因拟南芥发芽实验'>    5.3.5 过表达SlPLA₂α基因拟南芥发芽实验
•   5.4 讨论
•   5.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士期间所发表的学术论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 孙佰全

导师: 于丽杰

关键词: 番茄,胁迫,表油菜素内酯,拟南芥

来源: 哈尔滨师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,园艺

单位: 哈尔滨师范大学

分类号: Q943.2;S641.2

总页数: 77

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