基于原子力显微镜技术的毒素蛋白检测与动态成像研究

论文摘要

背景:生命科学的进步与发展离不开成像仪器的开发与成像技术的突破。如何通过成像技术来检测、分析生物大分子的各种变化,从中提取分子信息,定性、定量这些生物大分子等都具有重要的科学意义和应用价值。AFM以微悬臂作为力学信号媒介可直观展现生物大分子的超精细结构和各种物化性质,大大提高了我们对蛋白质结构和其在生化反应中所扮演角色的理解,为解决生物大分子功能和分子层面生理行为的生化问题提供了新的技术手段。目的:本研究旨在运用多模态AFM建立生物大分子检测与生物大分子互作研究平台的新方法。一是开发针对超痕量生物毒素的无标记甄别方法;二是建立在近生理条件下原位动态研究毒素生物学效应的新平台;三是与DNA折纸技术结合,通过设计毒素-DNA标签嵌合分子,对室温条件下的嵌合分子可控自组装行为进行前期先导研究,为进一步探索毒素受体与作用机制奠定基础。方法:1.在超痕量生物毒素无标记检测部分,选用ABR,RT,ETX,BoNT/A和SEB这5种生物毒素做为模型,分别进行提取纯化,并通过APTES修饰的云母进行表面固定,经过实验条件的优化使毒素蛋白在云母表面以单分子颗粒的形态沉积。首先采用AFM和PiFM对毒素单分子颗粒进行形貌与PiF反馈的成像,并以此对基底、缓冲液中盐成分和蛋白进行定性。其次收集各毒素蛋白颗粒的PiF谱,参考傅里叶变换红外吸收谱中酰胺带的吸收峰,筛选出10个与蛋白二级结构相关的特征PiF吸收带,并对这些信号带的峰位与强度做PCA分析。通过PCA的结果聚类每种毒素蛋白,构建针对每种毒素蛋白的单分子PiF谱数据库。最后混合三种毒素蛋白制作模拟样品,并对模拟样品进行PiFM表征,在一定区域收集模拟样品的PiF谱,将PiF谱导入先前构建好的毒素PCA模型,最终鉴定其所包含的毒素蛋白成分。2.在生物毒素原位动态成像研究部分,针对能够使人血红细胞具有成孔效应的ETX蛋白为研究模型,通过低渗缓冲液滋洗的方式制备单层人血红细胞外膜与内膜,运用环境可控的AFM平台在近生理条件下原位动态的观察ETX与内外膜的相互作用,表征毒素在不同温度,不同膜区域内成孔的特性,运用AFM探针分别表征完整红细胞膜与成孔红细胞膜的力学差异。结合重组红色荧光mScar ETX,通过共聚焦分析ETX受体在红细胞膜表面的分布。3.在生物毒素可控自组装研究部分,采用重组表达的方法设计N末端含有一个Cystein残基linker的c-linker-ETX蛋白,构建相应的原核表达载体行蛋白可溶性表达,纯化该重组c-linker-ETX,与末端修饰马来酰亚胺的寡核苷酸序列形成1对1的蛋白-核酸嵌合体蛋白,命名为DNA-c-linker-ETX,通过溶血实验与CD实验对比DNA-c-linker-ETX与rETX之间有无溶血和二级结构的差异。通过AFM原位观察4种不同结构的矩形DNA折纸（DNA origami）在室温下自组装的动力学特征,探讨origami缺损面积与结构特点对其室温下的合成与效率的影响。为研究ETX蛋白的可控组装奠定基础。结果:1.建立了超痕量生物毒素无标记检测方法。经过表面修饰与蛋白浓度优化,成功地在云母载片上制备了单分子毒素颗粒的样品,AFM表征与粒径分析均与参考蛋白结构和分子量所做的预期相一致。其中用BoNT/A代表大分子蛋白,ABR与RT代表中等大小分子蛋白,ETX与SEB代表小分子蛋白。气相条件下BoNT/A粒径在10 nm左右,ABR与RT在5 nm左右,ETX与SEB在2.5 nm左右。随后对每种毒素样品进行单波长PiFM表征,通过云母基底PiF信号的反转对基底上的蛋白颗粒分布进行了定性区分。对成像区域内的蛋白颗粒光诱导力谱的收集和PCA分析,将5种毒素蛋白进行了很好的聚类,以其中ABR、RT、ETX为例制备混合模拟样品,经收集PiF谱和PC分析,检测模拟样品中三种毒素蛋白ABR:RT:ETX的信号比分别为9:35:55,该检测值位于真实值（11:38:131）与理论值（2:3:5）之间。与傅里叶变换红外谱相比,光诱导力谱在酰胺信号带的分辨率更高且能直接显示代表蛋白二级结构归属的信号带。通过对每种毒素的PiFM成像比较发现,ETX与SEB的光诱导信号反馈远小于ABR,RT和BoNT/A,显示该检测体系对于分子量小于30 kDa的蛋白样品检测的不足。但可以将云母基底替换成增强Au基底加以改善。2.完成了对成孔蛋白ETX成孔效应的原位动态成像研究。Western blot实验与扫描电镜提示天然状态下ETX形成七聚体复合物与人红细胞膜相互作用,在红细胞膜表面成孔并破坏膜的完整性。高分辨AFM在近生理条件下原位观察了人红细胞膜孵育ETX后的形态变化,发现ETX只对人红细胞外膜具有成孔效应,其中通过环境可控AFM的动态成像发现当温度高于23℃时6μg/mL的rETX才使红细胞膜外成孔,而随着温度下降到23℃以内,成孔效应将停止。此外还观察到,ETX作用下,膜的完整性随时间而降低。通过制备“水泡”样结构的红细胞膜模型,显示ETX对于死细胞膜也具有成孔效应。3.对基于DNA折纸术的生物毒素单体可控自组装体系进行了前期研究。我们成功构建了位点特异性的DNA-c-linker-ETX嵌合蛋白,发现该嵌合策略不会对ETX的溶血活性及二级结构产生影响;对室温下自组装的DNA纳米结构的动力学特征研究发现,“接缝”结构能引导短链完成预退火形成的缺损DNA origami的生长。其正确折叠的效率与缺损的面积和预组装的结构相关。在“接缝”结构存在的条件下,1/4缺损的矩形origami能够在室温下获得90%的修复率。结论:本研究围绕多模态AFM在生物大分子检测、生物效应和纳米结构组装方面做出新的探索。首先,通过PiFM与PCA组合的策略,建立了蛋白毒素单分子无标记痕量检测方法,实现了对ABR,RT,ETX三种混合模拟毒素的甄别,并构建了ABR,BoNT/A,RT,ETX,SEB五种分子量不同、分子大小有别的生物毒素单分子PiF谱数据库;其次,应用高分辨AFM在近生理环境下对ETX蛋白与人血红细胞的成孔效应进行了原位、动态的表征。AFM结果显示在这个过程中ETX对红细胞内膜不产生成孔效应,且在无ATP活动的单层人血红细胞膜上同样能够完成与膜的特异性结合。AFM对成孔红细胞膜的高分辨成像未给出ETX七聚体复合物是构成红细胞膜表面孔洞的直接证据。最后,基于DNA折纸术设计并成功构建了DNA-c-linker-ETX嵌合蛋白,为下一步定量,可控的研究ETX七聚体在成孔过程中的角色提供了有力的工具,也为下一步研究生物大分子在生理条件下与origami的定向排列与功能验证提供理论基础。

论文目录

• 缩略语表
• 摘要
• Abstract
• 前言
•   参考文献
• 第一章 基于AFM光诱导力技术进行生物毒素的单分子鉴定
•   引言
•   1 实验材料
•     1.1 主要材料
•     1.2 主要试剂
•       1.2.1 修饰云母基底的试剂
•       1.2.2 蛋白制备及用于鉴定的试剂与材料
•       1.2.3 主要溶液的配置
•     1.3 主要仪器设备
•   2 实验方法
•     2.1 氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）云母基底的制备
•     2.2 毒素蛋白的制备
•       2.2.1 天然ABR与 RT粗毒的制备与亲和纯化
•       2.2.2 天然BoNT/A的制备与离子交换层析纯化
•       2.2.3 重组ETX的制备
•     2.3 毒素蛋白的蛋白含量测定
•     2.4 毒素蛋白的处理与液相AFM表征
•     2.5 毒素蛋白的处理与气相AFM和 PiFM表征
•     2.6 毒素蛋白的PiFM力谱收集与处理分析
•   3 实验结果
•     3.1 APTES-Mica的 AFM与 PiFM表征结果
•     3.2 毒素蛋白的纯化结果
•       3.2.1 ABR蛋白的纯化结果
•       3.2.2 RT蛋白的纯化结果
•       3.2.3 BoNT/A蛋白的纯化结果
•       3.2.4 ETX蛋白的纯化结果
•     3.3 毒素蛋白的AFM表征
•     3.4 部分毒素蛋白的傅里叶红外光谱
•     3.5 毒素蛋白的PiFM成像与PiF谱的收集
•     3.6 毒素蛋白的PCA分析
•     3.7 模拟样品的PiFM检测
•   4 小结与讨论
•   参考文献
• 第二章 用AFM成像技术研究ETX在人血红细胞的成孔特性
•   引言
•   1 实验材料
•     1.1 质粒、菌株、血红细胞
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要仪器设备
•     1.4 实验动物及动物伦理
•   2 实验方法
•     2.1 ETX 溶血实验
•     2.2 血红细胞的SEM成像
•     2.3 七聚体 westen-blot 实验
•     2.4 rETX与红细胞的激光共聚焦成像
•     2.5 氨基丙基三乙氧基硅烷云母基底的制备
•     2.6 单层红细胞膜的制备
•     2.7 ETX成孔的AFM成像
•   3 实验结果
•     3.1 ETX引起人红细胞溶血
•     3.2 人血红细胞与rETX作用的SEM表征
•     3.3 ETX七聚体westen-blot验证
•     3.4 rETX与红细胞的激光共聚焦成像
•     3.5 人红细胞膜的AFM表征
•     3.6 rETX对人红细胞成孔效应的表征
•     3.7 温度对rETX的人红细胞成孔效应的响应
•     3.8 rETX的人红细胞成孔效应的持续性
•     3.9 rETX对无生理活性红细胞膜的成孔效应
•     3.10 AFM对成孔细胞膜的高分辨观察
•   4 小结与讨论
•   参考文献
• 第三章 基于AFM成像技术和DNA纳米技术研究ETX蛋白的可控组装
•   引言
•   1 实验材料
•     1.1 基因、载体与菌株
•     1.2 主要试剂与仪器设备
•   2 实验方法
•     2.1 N端含有linker-cystein嵌合基因的ETX设计与合成
•     2.2 含嵌合基因的表达载体的构建与鉴定
•     2.3 工程菌c-linker-ETX/PTIG-trx/BL21 的诱导表达条件的确定
•     2.4 重组嵌合蛋白c-linker-ETX纯化条件的确定
•     2.5 重组嵌合蛋白 c-linker-ETX 免疫印迹实验
•     2.6 重组嵌合蛋白c-linker-ETX浓缩与定量
•     2.7 重组c-linker-ETX的圆二色谱验证
•     2.8 重组c-linker-ETX溶血活性的验证
•     2.9 DNA-c-linker-ETX嵌合蛋白的构建与表征
•       2.9.1 DNA-c-linker-ETX嵌合蛋白的构建
•       2.9.2 DNA-c-linker-ETX嵌合蛋白的表征
•     2.10 DNA origami的设计与合成
•     2.11 DNA origami的 AFM表征
•   3 实验结果
•     3.1 表达菌株c-linker-ETX/PTIG-trx/BL21 的鉴定
•     3.2 重组嵌合蛋白c-linker-ETX的诱导表达条件的确定
•     3.3 重组嵌合蛋白c-linker-ETX的纯化
•     3.4 嵌合蛋白c-linker-ETX的定量与抗原性分析
•     3.5 重组c-linker-ETX的验证
•       3.5.1 重组c-linker-ETX的质谱验证
•       3.5.2 重组c-linker-ETX的圆二色谱验证
•       3.5.3 重组嵌合蛋白c-linker-ETX的溶血效应
•     3.6 DNA-c-link-ETX嵌合蛋白的构建
•       3.6.1 NH2-DNA的 MAL-NHS修饰
•       3.6.2 c-link-ETX的巯基活化
•       3.6.3 DNA-c-link-ETX嵌合蛋白的合成与表征
•     3.7 含有“接缝”结构的DNA origami的室温条件下的自组装
•     3.8 “接缝”结构对DNA origami产量和生长时间的分析
•   4 小结与讨论
•   参考文献
• 第四章 结论与展望
• 附录 A 用于合成矩形origami结构的DNA序列
• 综述
•   参考文献
• 作者在学期间取得的学术成果
• 附件
• 主要简历
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 冀斌

导师: 王景林,宋杰

关键词: 原子力显微镜,生物毒素,单分子检测,成孔蛋白,嵌合蛋白

来源: 军事科学院

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 军事科学院

分类号: Q-336

总页数: 161

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