慢病毒介导稳定表达增强小反刍兽疫病毒复制的山羊Vero/SLAM细胞系的建立

论文摘要

利用Gateway技术和慢病毒表达系统将山羊淋巴细胞信号活化因子SLAM稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,建立稳定表达可增强小反刍兽疫病毒（PPRV）复制的SLAM的Vero阳性细胞亚克隆,并验证阳性细胞亚克隆Vero/SLAM表达SLAM的活性、遗传稳定性及其对PPRV复制的增殖效果。分离山羊外周血淋巴细胞,提取基因组Total RNA,一步RT-PCR获得完整ORF的SLAM基因,采用BP及LR位点的基因重组技术,构建入门载体pDONR/SLAM并获得表达骨架pDEST/SLAM,与Packaging Mix pLP1、pLP2及VSV-G共转染293-FT细胞,获得SLAM复制缺陷型慢病毒样粒子,用其感染Vero细胞,杀稻瘟菌素抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过靶标基因扩增、间接免疫荧光、激光扫描共聚焦显微技术、Western blot免疫印迹检测技术、致细胞病变效应及Realtime RT-PCR等技术分别验证SLAM基因组整合、转录,SLAM蛋白表达、反应活性以及PPRV在表达SLAM阳性细胞亚克隆上的增殖效果。结果显示:SLAM受体基因被稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,该受体蛋白表达于细胞周质,建立的细胞连续传代不丢失,接种病毒后致细胞病变时间由4～7d缩短为3.5d,TCID50·0.1mL-1由4.25增加为5.67,相对于正常Vero细胞,整合有SLAM的Vero细胞,由于表达了PPRV特异的细胞受体使PPRV对其易感性显著增强。成功建立一株稳定表达靶向增强PPRV复制的Vero/SLAM细胞:该细胞表达的SLAM具有明显增强PPRV复制的功能,不仅可以从细胞模型水平阐明增强PPRV复制的关键靶基因,也为PPRV感染引起宿主细胞的变化以及对机体的致病机制等提供研究工具。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•   1.2 靶标基因表达骨架pDEST/SLAM的构建及其鉴定
•     1.2.1 靶标基因的获得
•     1.2.2 靶标基因的Entry clone载体构建及表达骨架pDEST/SLAM的获得
•   1.3 复制缺陷型慢病毒样粒子的获得及感染阳性克隆细胞株的筛选
•     1.3.1 pDEST/SLAM表达骨架包装成完整病毒
•     1.3.2 Vero细胞对Blasticidin抗性压力耐受浓度的确定
•     1.3.3 pDEST/SLAM转基因阳性细胞克隆的筛选
•   1.4 转基因阳性细胞功能验证
•     1.4.1 pDEST/SLAM基因稳定整合以及遗传稳定性鉴定
•     1.4.2 转基因Vero/SLAM细胞表达SLAM受体验证
•     1.4.3 转基因Vero/SLAM细胞表达SLAM细胞定位
•     1.4.4 转基因Vero/SLAM细胞接种PPRV弱毒株后表达SLAM增强PPRV复制的验证
•       1.4.4. 1 致细胞病变及细胞毒价:
•       1.4.4. 2 间接免疫荧光验证转基因阳性细胞由于表达SLAM增强PPRV复制情况:
•       1.4.4. 3 Real-time RT-PCR验证PPRV在Vero/SLAM敏感细胞上的增殖效果:
• 2 结果
•   2.1 慢病毒介导靶标基因表达骨架pDEST/SLAM的构建及其鉴定
•   2.2 Vero细胞耐受Blasticidin抗性最低浓度的确定
•   2.3 Vero转基因阳性细胞的获得
•   2.4 Vero/SLAM转基因阳性细胞基因整合以及遗传稳定性鉴定
•   2.5 Vero/SLAM转基因阳性细胞表达SLAM的Western blot验证
•   2.6 转基因Vero/SLAM细胞表达SLAM细胞定位
•   2.7 Vero/SLAM细胞接种PPRV后产生细胞病变效应以及间接免疫荧光情况
•   2.8 转基因阳性细胞增强PPRV复制
•   2.9 Real-time RT-PCR验证PPRV在Vero/SLAM敏感细胞上的增殖效果
• 3 讨论
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 吴锦艳,田宏,蒙学莲,惠小婷,王耀杰,关玉华,尚佑军,刘永生,张志东

关键词: 小反刍兽疫病毒,细胞系,技术,慢病毒表达系统

来源: 畜牧兽医学报 2019年01期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室

基金: 国家现代肉羊产业技术体系项目(CARS-39-04B),甘肃省科技支撑计划项目(1604NKCA059),内蒙科技重大专项“巴美肉羊产业化技术研究与集成应用”

分类号: S852.65

页码: 218-226

总页数: 9

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