徐宪连（山东省淄博市桓台县人民医院山东淄博256400）
【摘要】目的观察缬纱坦后处理对离体大鼠心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion,I/R）细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响。方法利用Langendorff离体心脏灌流装置，采用完全复灌/停灌的方法制备I/R模型。24只SD大鼠随机等分为：①对照（sham）组：K-H液持续灌流110min；②I/R组：停灌30min，复灌60min；③缬纱坦后处理（Povst）组：I/R+缬沙坦1μmol/L（再灌注头15min给药）。Hoechst荧光染色观察凋亡情况，计算凋亡指数（AI）；Westernblot检测Bcl-2、Bax的表达。结果sham组凋亡细胞零星分布（AI=3.48±0.38），另两组均有大量凋亡细胞存在，且Povst组AI（25.87±1.04）明显低于I/R组（36.99±2.26）（P<0.05）；Bcl-2、Bax的表达在I/R、Povst组均明显高于sham组（P<0.01），Povst组Bcl-2的表达明显高于I/R组（P<0.01），而Bax的表达与I/R组无显著差异（P>0.05）。结论缬纱坦后处理抑制离体大鼠心肌再灌注细胞的凋亡，与上调Bcl-2表达、增加Bcl-2/Bax比值有关。
【关键词】缬纱坦后处理Bcl-2Bax
随着溶栓及PCI的广泛应用,心肌再灌注损伤越来越引起人们的重视，减轻甚至避免再灌注损伤已成为人们的研究热点。缺血后处理[1]是指心肌长时间缺血后、再灌注即刻给予的几次短暂再灌注/缺血刺激，它有效减轻再灌注损伤，且与抑制细胞凋亡有关。缬沙坦能抑制心肌细胞的凋亡[2]，而缬沙坦后处理对细胞凋亡的影响未见报道。本实验排除了神经、体液等因素，观察缬沙坦后处理对再灌注心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的直接影响，为药物后处理的应用提供理论依据。
1材料和方法
1.1实验动物和分组
雄性SD大鼠24只,随机等分为：①对照（sham）组：K-H液（NaCl118,NaHCO325,KH2PO41.2,KCl4.8,MgSO41.2,CaCl22.0,葡萄糖11.0，单位mmol/L）持续灌注110min;②缺血再灌注（I/R）组:停灌30min,再灌60min；③缬纱坦后处理（Povst）组：I/R+缬沙坦1μmol/L（再灌注头15min给药）。
1.2模型的制备
麻醉起效后开胸、取心，悬挂Langendorff装置上，行主动脉逆行灌流（以95%O2+5%CO2饱和的KH液）。MedLab生物信号采集处理系统(南京美易生物有限公司)显示、记录。采用完全复灌/停灌的方法复制I/R模型。
1.3凋亡细胞形态的观察及凋亡指数的测定
取材、固定，制成石蜡切片行Hoechst染色，Zeiss荧光显微镜（德国CarlZeiss公司）下胞体变小、胞核致密浓染或呈碎块状致密浓染的明亮蓝色细胞即凋亡细胞。凋亡细胞占细胞总数的百分比为凋亡指数（apoptosisindex,AI）。
1.4Bcl-2、Bax的表达
取材、裂解、离心、取上清，BCA法测蛋白浓度。取样SDS-PAGE电泳，转膜脱脂后加Bcl-2或Bax抗体（1:200）；TBST洗膜，加NBT/BCIP（碧云天生物技术研究所）孵育显色。GENEGENIUS（美国sygene公司）分析各条带灰度，以GAPDH（1:1000）作内参，计算各灰度与内参灰度比值。
1.5统计学处理?
SPSS13.0分析处理，计量资料以均数±标准差（-x±s）表示，多组间差异用单因素方差分析，多组间两两比用?Tamhane’sT2检验，以P<0.05为差异有显著性。
2结果
2.1凋亡细胞形态及细胞AI的变化
Hoechst染色见sham组凋亡细胞零星分布（AI=3.48±0.38），另两组均有大量凋亡细胞存在，且Povst组AI（25.87±1.04）明显低于I/R组（36.99±2.26）（P<0.05）（图1）。
图1各组凋亡情况（X400）A:sham组；B:I/R组；C:Poval组
2.2Bcl-2、Bax的表达
IR、Povst组Bcl-2、Bax的表达均明显高于sham组（P<0.01）；Povst组中Bcl-2的表达明显高于I/R组（P<0.05），而Bax的表达与I/R组无显著性差异（P>0.05）（图2）。
图2?Westernblot结果A、B分别为Bcl-2、Bax的表达，下图是其相对灰度比。
1：sham组；2：Povst组；3：I/R组。
3讨论
缺血后处理的心肌保护作用已经得到证实，抑制细胞凋亡是其作用机制之一。后处理是心肌缺血后施行的，能在PCI及外科手术中操作，但溶栓过程中难以实施。再灌注同时给予某种药物即药物后处理，如果能起到与缺血后处理同样的效果，将减轻反复缺血对局部血管造成的直接刺激，种种原因，目前尚无一种药物以后处理的方式在临床应用，因此，寻找一种以后处理方式给予的药物减轻再灌注损伤具有重要的临床意义。
本实验在离体大鼠心肌缺血30min再灌注60min后观察到大量凋亡细胞的存在，证实IR过程中确有细胞凋亡发生；同时发现AI在Povst组明显低于IR组，表明缬沙坦后处理抑制了IR?过程中细胞的凋亡，与文献报道[3]一致。
凋亡是多因素引起、多分子参与的复杂过程，受多种蛋白因子调控,其中Bcl-2、Bax备受关注，两者能相互作用形成同源或异源性二聚体从而发挥不同作用：当Bax高表达时形成同源Bax/Bax，细胞发生凋亡；而Bcl-2高表达时则形成异源性Bcl-2/Bax，这时凋亡受到抑制。因此，二者在细胞中的相对量即两者的比例是决定细胞凋亡与否的关键因素[4]。本实验中Bcl-2、Bax在sham组仅微量表达，IR后表达增加；与IR组相比，Povst组中Bcl-2的表达增加，Bax的表达却无显著差异，致使Bcl-2/Bax比值高于IR组。由此看来，缬沙坦后处理对细胞凋亡的抑制部分是通过上调Bcl-2、增加Bcl-2/Bax比值实现的。
综上所述，缬沙坦后处理通过上调Bcl-2表达、增加Bcl-2/Bax比值抑制IR过程中细胞凋亡，可在溶栓过程中实施，有望在临床推广应用。
参考文献
[1]ZhaoZQ，CorveraJS，HalkosME，etal.Inhibitionofmyocardialinjurybyischemicpostconditioningduringreperfusion:comparisonwithischemicpreconditioning[J]AmJPhysiol，2003，285：H579-H588.
[2]AngelisN,FiordalisoF,LatiniR,etal.AppraisaloftheRoleofAngiotensinIIandAldosteroneinVentricularMyocyteApoptosisinAdultNormotensiveRat.JMolCellCardiol,2002,34:1655-1665.
[3]MarieMB,KristineBO,NielsE,etal.TheangiotensinIItype1receptorantagonistLosartanbindsandactivatesbradykininB2receptorsignaling[J].RegulatoryPeptides,2011,167:21-25
[4]DelPrincipeMI,DelPoetaG,VendittiA,etal.Apoptosisandimmaturityinacutemyeloidleukemia[J].Hematology,2005,10:25-34.