脲和盐酸胍在蛋白质折叠中作用的分析

论文摘要

蛋白质折叠一直是生命科学领域的一个研究难点问题。目前,关于新生肽链折叠的研究取得了非常大的进展。在体内,已明确分子伴侣是调控新生肽链非折叠肽的疏水表面快速、准确的完成折叠的关键。其功能是识别新生肽段折叠过程中暂时暴露的错误结构的,与没有折叠或部分折叠的多肽链的疏水表面结合生成复合物,阻止不正确的非功能的折叠途径,抑制不可逆聚合物产生,诱发多肽链折叠形成正确构象,并调节折叠过程能量。但是,在体外,大肠杆菌（E.coli）所表达的绝大多数真核细胞蛋白缺少自我复性能力,在溶液中不能自发形成有活性功能的构象,成为不可溶、无活性聚集体的包涵体（Inclusion body）。包涵体复性仍然是大规模获得有活性功能蛋白的“瓶颈”问题。近年来,模拟体内的蛋白质折叠过程和环境,添加剂辅助的稀释法和液相色谱法已显示出在蛋白折叠中所具有的潜力。研究发现,复性缓冲液或色谱流动相中添加一定的变性剂在辅助蛋白质折叠过程中发挥着重要作用,即通过在复性过程中添加不同浓度的脲或盐酸胍以抑制变性蛋白聚集体的形成。不但能破坏蛋白错误折叠中间体的稳定性,还可增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性以及折叠产率。但是,不同的蛋白质对其添加变性剂的浓度大不相同,为了更加深入的了解添加脲和盐酸胍对变性蛋白达到正确折叠效果,探讨不同变性剂对蛋白折叠过程构象、微环境、主要作用力变化以及热力学状态的影响。在本论文中,以模型蛋白和大肠杆菌表达包涵体作为研究对象,采用稀释法和一种新型以色氨酸为配基的混合模式色谱固定相进行研究,通过荧光光谱法、同步荧光光谱法、圆二色谱法并结合等温滴定量热法（ITC）分析手段,分别从光谱性能和热力学的变化探究目标蛋白折叠过程中添加不同变性剂的作用及其作用机制。这些研究将对寻找适合于蛋白质高效复性以及大规模生产蛋白质的新手段,快速推动重组蛋白等产品的产业化进程,对科学研究与生产均具有重要的理论意义和指导意义。论文包括以下四个部分:1.文献综述近十年来,生物体内蛋白质折叠和致病蛋白聚集体过程的研究取得了很大的进展。可以说,蛋白质折叠实际上是自然界一个基本的生物过程。所以,体外蛋白折叠要使之处于一个适当的环境,如低浓度变性剂抑制其聚集,含二硫键蛋白还必需有适当的氧化还原条件等形成天然蛋白。因此,本部分将对蛋白质的变性与折叠的研究与发展,蛋白质主要折叠的方法与分析手段的进展等进行综述。2.脲和盐酸胍在稀释法辅助蛋白质折叠中作用的分析研究表明,稀释添加剂法在辅助蛋白质折叠中发挥了重要作用。因此,以含有二硫键碱性蛋白-溶菌酶（Lys）和不含二硫键酸性蛋白-碳酸酐酶（Car）为研究对象,利用荧光光谱法、同步荧光光谱法和圆二色谱法作为分析手段,系统地研究不同浓度的变性剂（脲和盐酸胍）对非还原和还原变性Lys/Car复性效果,包括变性剂浓度对构象、折叠微环境和生物活性的影响,发现胍的变性能力比脲强,复性过程氨基酸微环境极性减弱,疏水性增强,相反,在变性过程中微环境极性增强,疏水性减弱;复性缓冲液中变性剂浓度过低时不利于Lys/Car二级结构的形成。3等温滴定量热法对变性剂辅助蛋白质折叠作用的分析等温滴定量热法（ITC）的最大优势是通过一次滴定便可提供被研究体系的热力学参数。因此,以溶菌酶（Lys）和碳酸酐酶（Car）为研究对象,利用ITC的多滴实验体系模拟变性蛋白在线稀释复性的热力学参数结果显示,在脲和胍浓度为4.0-5.0 mol/L时,其?H>0,?S>0,对Lys/Car的复性作用以疏水作用力为主;在3.0 mol/L脲中,?H<0,?S<0,对Lys/Car的复性作用以氢键和范德华力为主;但是,在胍浓度3.0 mol/L时,?H<0,?S>0,Lys的复性作用以静电作用力为主;Car在胍浓度3.0 mol/L时,出现两个阶段,第一阶段?H<0,?S<0,以氢键和范德华力为主,第二阶段?H<0,?S>0,以静电作用力为主。利用ITC并结合圆二色谱、荧光光谱分析在不同脲浓度下柱上Lys和Car复性效果的结果显示,一步色谱可以使Lys/Car构象符合天然态的特征,达到了热力学平衡态。4.等温滴定量热法对变性剂辅助包涵体复性与同时纯化作用的分析在前述实验基础上,利用ITC的多滴实验体系分别对重组人Notch配体Delta-like 1（rhDll1）、链霉亲和素（streptavidin,STV）、重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）进行在线稀释复性的热力学参数结果显示,在脲浓度为4.0 mol/L和5.0 mol/L时,?H>0,?S>0,三种溶解于强变性剂的包涵体复性过程作用均以疏水作用力为主;在脲浓度为3.0 mol/L时,STV复性过程的?H>0,?S>0,以疏水作用力为主;rhDll1复性过程的?H<0,?S<0,以氢键和范德华力为主;rhG-CSF复性过程分为两个阶段,第一阶段?H<0,?S<0,以氢键、范德华力为主,第二阶段?H<0,?S>0,以静电作用力为主。利用圆二色谱并结合ITC法分析不同色谱模式下对STV、rhG-CSF、rhDll1包涵体复性的效果,结果显示,经一步色谱可以实现STV、rhG-CSF、rhDll1复性与同时纯化,目标蛋白符合蛋白质二级结构（α-螺旋）特性和达到了热力学平衡态。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 蛋白质变性与折叠
•   1.2 蛋白质折叠的主要方法
•     1.2.1 溶液中变性蛋白复性
•     1.2.2 液-固界面上变性蛋白的复性
•     1.2.3 小分子添加剂在变性蛋白复性中的作用
•   1.3 蛋白质折叠的分析与表征
•     1.3.1 复性蛋白质的构象表征
•     1.3.2 折叠蛋白的热力学分析
•   1.4 等温滴定量热法
•     1.4.1 等温滴定量热法的工作原理
•     1.4.2 等温滴定量热法的应用
•   1.5 本论文的研究意义与内容
•   参考文献
• 第二章 脲和盐酸胍在稀释法辅助蛋白质折叠中作用的分析
•   2.1 引言
•   2.2 仪器与试剂
•     2.2.1 主要仪器
•     2.2.2 主要试剂
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 变性蛋白的制备
•     2.3.2 稀释法复性变性蛋白
•     2.3.3 荧光光谱法
•     2.3.4 同步荧光光谱法
•     2.3.5 圆二色光谱法
•     2.3.6 生物活性测定
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 脲和盐酸胍对溶菌酶复性的荧光光谱分析
•     2.4.2 脲和盐酸胍对碳酸酐酶复性的荧光光谱分析
•     2.4.3 脲和盐酸胍对溶菌酶同步荧光光谱分析
•     2.4.4 脲和盐酸胍对碳酸酐酶同步荧光光谱分析
•     2.4.5 圆二色光谱法对复性蛋白的二级结构分析
•     2.4.6 复性蛋白生物活性的测定
•   2.5 本章小结
•   参考文献
• 第三章 等温滴定量热法对变性剂辅助蛋白质折叠作用的分析
•   3.1 引言
•   3.2 仪器与试剂
•     3.2.1 实验试剂
•     3.2.2 实验仪器
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 变性蛋白的制备
•     3.3.2 在线滴定稀释复性蛋白
•     3.3.3 色谱柱装填
•     3.3.4 色谱条件
•     3.3.5 色谱馏分的荧光光谱分析
•     3.3.6 色谱馏分的圆二色谱分析
•     3.3.7 色谱馏分的等温滴定量热法分析
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 等温滴定量热法在线滴定变性蛋白的讨论
•     3.4.2 等温滴定量热法对复性Lys的作用力分析
•     3.4.3 等温滴定量热法对复性Car的作用力分析
•     3.4.4 在HIC模式下对Lys的复性
•     3.4.5 在WCX模式下对变性Car的复性
•     3.4.6 荧光光谱法对复性前后蛋白的分析
•     3.4.7 圆二色谱对复性蛋白的构象的分析
•     3.4.8 等温滴定量热法测定复性蛋白的热力学变化
•   本章小结
•   参考文献
• 第四章 等温滴定量热法对变性剂辅助包涵体复性与同时纯化作用的分析
•   4.1 引言
•   4.2 仪器与试剂
•     4.2.1 主要仪器
•     4.2.2 主要试剂
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 重组蛋白包涵体的制备
•     4.3.2 色谱条件
•     4.3.3 目标蛋白理化性能分析
•     4.3.4 等温滴定量热法在线稀释复性包涵体
•     4.3.5 复性重组蛋白的热力学分析
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 等温滴定量热法对包涵体复性的热力学分析
•     4.4.2 在HIC模式下对重组链霉亲和素复性与同时纯化
•     4.4.3 在HIC模式下对重组人粒细胞集落刺激因子复性与同时纯化
•     4.4.4 在WCX模式下对重组人Notch配体Delta-like1 复性与同时纯化
•     4.4.5 圆二色谱法分析复性与同时纯化蛋白构象
•     4.4.6 SDS-15%PAGE对不同色谱馏分的分析
•     4.4.7 等温滴定量热法表征包涵体复性
•   4.5 本章小结
•   参考文献
• 结论
• 攻读硕士学位期间取得的科研成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王思尧

导师: 王骊丽

关键词: 蛋白质折叠复性,变性剂,稀释法,液相色谱法,等温滴定量热法,包涵体

来源: 西北大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西北大学

分类号: Q51

总页数: 95

文件大小: 3968K

下载量: 200