乙脑病毒包膜蛋白279位氨基酸突变对病毒神经毒力的影响

论文摘要

目的:构建乙脑病毒（JEV）野毒株SA14包膜蛋白K279M突变病毒感染性克隆,拯救病毒,并用动物实验探讨JEV包膜蛋白279位氨基酸突变对病毒神经毒力的影响。方法:以JEV包膜蛋白cDNA为模板,用重叠延伸PCR技术与分子克隆技术构建含有rJEV SA14包膜蛋白279位氨基酸,由赖氨酸（K）突变为甲硫氨酸（M）的全长cDNA质粒pACNR-JEV SA14（K279M）,并以其为模板体外转录获得RNA,转染BHK21细胞进行病毒包装得到恢复病毒JEV SA14（K279M）。用蚀斑实验、间接免疫荧光实验以及病毒测序等方法鉴定恢复病毒。比较恢复病毒JEV SA14（K279M）和rJEV SA14、突变株JEV SA14-14-2（M279K）、乙脑疫苗株（rJEV SA14-14-2）的蚀斑大小、生长特点以及对昆明鼠和7日龄乳鼠的神经毒力等方面的差异。结果:感染性克隆经酶切、测序鉴定表明已成功构建。病毒测序结果表明:恢复病毒JEV SA14（K279M）除在1813位碱基处人为引入A→T的突变（导致K279M突变）外,未发生其它突变。经间接免疫荧光实验证实,恢复病毒JEV SA14（K279M）感染BHK21细胞组能被抗JEV包膜蛋白抗体识别。病毒蚀斑实验发现:JEV SA14（K279M）的蚀斑直径最大,其次依次为rJEV SA14、rJEV SA14-14-2和JEV SA14-14-2（M279K）。病毒生长曲线发现:在感染复数为0.01时,恢复病毒JEV SA14（K279M）的病毒滴度在感染48小时后可达峰值(8.03 log10PFU/ml),而rJEV SA14、rJEV SA14-14-2、JEV SA14-14-2（M279K）的病毒滴度在60小时达高峰。神经毒力研究发现:rJEV SA14和JEV SA14（K279M）对昆明小鼠的神经毒力（LD50）分别为0.05PFU/0.03ml和0.21PFU/0.03ml;rJEV SA14-14-2和JEV SA14-14-2（M279K）对7日龄乳鼠的神经毒力（LD50）分别为0.52PFU/0.02ml和0.19PFU/0.02ml。结论:成功构建含K279M位点突变病毒的感染性克隆,并获得拯救病毒JEV SA14（K279M）。包膜蛋白279位点的突变会显著影响病毒的蚀斑大小,并对病毒的生长和病毒的神经毒力有一定影响。同时发现:蚀斑大小并不一定能反应病毒的毒力,体外实验和体内实验存在较大的偏差。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 前言
• 实验材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述:黄病毒属嵌合疫苗研究新进展
•   参考文献
• 附录
• 个人简历
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 冯亚岚

导师: 杨健

关键词: 乙脑病毒,回复突变,神经毒力

来源: 川北医学院

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 川北医学院

分类号: R373

DOI: 10.27755/d.cnki.gcbyx.2019.000081

总页数: 60

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