稀有鮈鲫HSP70基因启动子的克隆及功能分析

论文摘要

热休克蛋白70（HSP70）作为一种分子伴侣,在环境毒理学中受到广泛研究。前期研究表明稀有鮈鲫HSP70基因（GrHSP70）表达量与五氯酚（pentachlorophenol,PCP）处理的浓度和时间在肝脏中呈现剂量/时间-依赖效应。为探究启动子在热休克蛋白70表达调控中的作用,根据已知的GrHSP70 c DNA序列,采用染色体步移技术克隆了GrHSP70的5’侧翼区的核苷酸序列。生物信息学分析从预测的转录起始位点（C）起的5’侧翼区域共1 487bp,潜在的转录因子结合位点包括雌激素响应元件（ERE）、Sp1结合位点（Sp1）、糖皮质激素响应元件（GRE）、TATA结合蛋白（TBP）、CCAAT/增强子蛋白结合位点（C/EBP）、Oct-1结合位点（Oct-1）、GATA转录因子结合位点（GATA-1）等。实验构建了含有启动子缺失片段的萤火虫萤光素酶（firefly luciferase）和海肾萤光素酶（renilla luciferase）报告基因表达载体,瞬时转染HeLa细胞后,利用双荧光活性检测确定获得的GrHSP70启动子具有启动活性,其核心启动位点位于转录起始点上游-1 487～-1 093bp。同时,用不同浓度PCP暴露成功转染了重组质粒（pGL-HSP70 promoter-Luc+）的HeLa细胞,培养24h后检测双荧光活性,与对照相比,随PCP浓度的增加,荧光活性均显著增加。说明在稀有鮈鲫肝脏中PCP会通过激活GrHSP70启动子来诱导GrHSP70表达,但PCP在稀有鮈鲫体内通过何种机制来调节HSP70的合成,仍然需要进一步研究。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 实验材料
•   1.2 主要试剂
•   1.3 实验方法
•     1.3.1 稀有鮈鲫DNA的提取
•     1.3.2 GrHSP70启动子区域的克隆与测序
•     1.3.3 生物信息学分析
•     1.3.4 GrHSP70基因启动子表达载体的构建
•     1.3.5 细胞培养、瞬时转染及活性测定
•     1.3.6 GrHSP70基因启动子缺失分析
•     1.3.7 不同浓度PCP对GrHSP70启动子活性的影响
• 2 结果
•   2.1 Gr HSP70启动子克隆及生物信息学分析
•   2.2 Gr HSP70基因启动子活性鉴定
•   2.3 GRHSP70启动子缺失片段的扩增及双荧光活性的测定
•   2.4 不同浓度PCP对Gr HSP70启动子活性的影响
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 黄宇,黄书婷,张夕梅,刘堰

关键词: 稀有鮈鲫,热休克蛋白,启动子,瞬时转染,功能分析

来源: 中国生物工程杂志 2019年10期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西南大学生命科学学院淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室三峡库区生态环境教育部重点实验室

分类号: Q78

DOI: 10.13523/j.cb.20191002

页码: 9-16

总页数: 8

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