鸭半乳糖凝集素-1在宿主抗鸭瘟病毒感染中的作用研究

论文摘要

半乳糖凝集素（Galectins）是凝集素（lectin）家族中的一员,主要包含15种碳水化合物结合蛋白,并且在动物进化中高度保守。已经有15种哺乳动物galectin被识别和鉴定,动物半乳糖凝集素是具有保守CRD（Carbohydrate-recognition domain）的S型凝集素的一部分,在动物中,galectins具有防御某些细菌、真菌和病毒的作用。Galectins具有多种生物学功能,它们在炎症反应、细胞生长、细胞运输和抗病毒反应中发挥重要作用。Galectins可以与某些细胞诱导的聚糖结构或某些微生物的聚糖结合,表明它们具有识别病原体的作用。作为同型二聚体,原型galectin-1被发现存在于多种免疫相关组织中,如胸腺上皮细胞、T细胞、巨噬细胞和受刺激的B细胞,另外galectin-1还可以作为T细胞的重要调节剂出现。许多不同的器官和细胞可以表达半乳糖凝集素,包括肌肉、心脏、肝脏、肾脏、前列腺、淋巴结、脾脏、胸腺、胎盘、视网膜,以及其他免疫和非免疫细胞中。在机体发生炎症反应期间,它可以在被感染的上皮细胞、活化的巨噬细胞和内皮细胞中释放,调节T细胞中细胞因子（如IFN-γ和TNF-α）的产生。虽然galectin-1在哺乳动物身上的研究已经非常广泛和深入,但在家禽方面的研究还比较少。鉴于此,本研究第一次系统研究了樱桃谷肉鸭galectin-1的生物学功能及其与抗鸭瘟病毒天然免疫反应之间的关系。研究内容主要分为以下三个部分:第一部分樱桃谷肉鸭半乳糖凝集素-1基因的扩增与序列鉴定根据预测的鸭galectin-1的基因序列设计同源重组引物,提取樱桃谷肉鸭脾脏组织RNA,反转录得到cDNA,使用特异性引物（duGal-1-F1/R1）扩增得到目的片段,经测序后发现蛋白质编码区（Sequence coding for amino acids in protein,CDs）由405bp组成,编码135个氨基酸,其分子量约为14.8kDa。使用SMART等软件分析后结果显示目的蛋白中不含特殊的信号肽和跨膜结构。根据系统进化树的结果发现,本研究克隆的galectin-1序列与绿头鸭的同源性最高,同源性为98.8%,与鸡的同源性为87.2%,与哺乳类和爬行类的亲缘关系较远。第二部分Galectin-1在樱桃谷肉鸭组织中的分布情况分别从健康樱桃谷肉鸭的心脏,肝脏,脾脏,肺脏,肾脏,脑,小脑,脑干,胸腺,胰腺,法氏囊,气管,食道,肌胃和腺胃这21个组织中提取总RNA来确定galectin-1在各个组织的分布情况。使用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）检测,结果表明健康樱桃谷鸭体内中气管、肺和皮肤中的galectin-1的表达量较高,心脏中表达量最高,galectin-1在肝脏,脾脏,肾脏,胸腺,回肠,十二指肠和空肠中的表达量较弱。樱桃谷肉鸭感染鸭瘟病毒后,检测到galectin-1的表达量发生上调。与未攻毒组相比,攻毒组肝脏中的galectin-1在攻毒后第一天（Day post infection,dpi）时增加了4.5倍,在3 dpi时增加了2.8倍,并且在4 dpi时达到了1.7倍;在脾脏中,galectin-1的表达量在短时间内大大增加,1 dpi时为8.2倍,2 dpi为4.3倍;在脑中,galectin-1的表达量在1dpi和2 dpi时显着上调,但是在3 dpi和4 dpi时有所下降。第三部分Galectin-1诱导的相关细胞因子和ISGs表达量的检测为获知galectin-1所介导的抗病毒天然免疫反应过程,本实验通过干扰RNA和过表达galectin-1两种方法研究了galectin-1的表达与相关细胞因子表达量之间的关系。研究发现,过表达galectin-1后,ISGs（Mx、PKR、OAS）和部分细胞因子,例如IL-2、IL-1β、IFN-α等的表达量均有不同程度的上调,Mx上调8.4倍,OAS上调6.8倍。炎性细胞因子IL-1β,IL-2均有不同程度的增加,IFN-α的表达量发生了显著上调。相反,通过干扰RNA对galectin-1的表达进行敲弱后,结果发现,ISGs和部分炎性细胞因子的表达量出现下调,例如在24 hpi,Mx下调4.2倍,IL-1β下调4.5倍,结果表明galectin-1能够诱导ISGs和其他细胞因子的表达上调,介导宿主的抗病毒免疫反应。过表达duGal-1或干扰galectin-1的表达后,检测病毒载量,结果表明galectin-1对感染早期阶段鸭瘟病毒的复制具有显著的抑制作用。本实验为将来深入分析禽类galectin-1在天然免疫应答中涉及的信号通路及其对鸭瘟病毒复制的抑制作用提供了可能。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
•   1.1 半乳糖凝集素简介
•     1.1.1 半乳糖凝集素的发展史
•     1.1.2 半乳糖凝集素的产生机理
•     1.1.3 半乳糖凝集素的分类和基本特性
•     1.1.4 半乳糖凝集素的结构
•     1.1.5 半乳糖凝集素的抗病毒作用及机理
•     1.1.6 半乳糖凝集素的抗肿瘤作用
•     1.1.7 半乳糖凝集素的调节作用
•   1.2 半乳糖凝集素-1概述
•     1.2.1 半乳糖凝集素-1简介
•     1.2.2 半乳糖凝集素-1的分子结构和功能
•     1.2.3 半乳糖凝集素-1的研究进展
•   1.3 天然免疫系统概况
•     1.3.1 天然免疫系统
•     1.3.2 白细胞介素
•     1.3.3 干扰素
•   1.4 鸭瘟病毒研究进展
•   1.5 课题研究目的及意义
• 2 材料和方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 病毒株和细胞
•     2.1.2 试验动物
•     2.1.3 主要实验试剂和引物
•     2.1.4 主要实验溶液的配制
•     2.1.5 主要实验设备
•     2.1.6 分子生物学分析软件
•   2.2 实验方法
• 50 的测定'>    2.2.1 病毒TCID₅₀的测定
•     2.2.2 动物实验设计与组织获取
•     2.2.3 樱桃谷肉鸭半乳糖凝集素-1 的克隆和序列分析
•       2.2.3.1 樱桃谷肉鸭半乳糖凝集素-1 的克隆
•       2.2.3.2 樱桃谷肉鸭半乳糖凝集素-1 的氨基酸序列分析
•       2.2.3.3 樱桃谷肉鸭半乳糖凝集素-1 的进化树分析
•     2.2.4 樱桃谷肉鸭半乳糖凝集素-1 真核表达载体的构建
•       2.2.4.1 樱桃谷肉鸭半乳糖凝集素-1 的克隆
•       2.2.4.2 真核表达载体PEGFP的准备
•       2.2.4.3 目的基因和载体的同源重组
•       2.2.4.4 阳性质粒的鉴定和质粒提取
•     2.2.5 组织RNA/DNA提取与cDNA合成
•     2.2.6 樱桃谷肉鸭体内半乳糖凝集素-1 的分布情况
•       2.2.6.1 健康樱桃谷肉鸭体内半乳糖凝集素-1 的分布情况
•       2.2.6.2 感染鸭瘟病毒后樱桃谷肉鸭体内半乳糖凝集素-1 的分布情况
•     2.2.7 过表达半乳糖凝集素-1的DEFs细胞中细胞因子表达量的变化
•       2.2.7.1 制备鸭胚成纤维细胞
•       2.2.7.2 在DEFs细胞上过表达duGal-1 质粒
•       2.2.7.3 过表达后细胞因子表达量的变化分析
•     2.2.8 干扰RNA
•     2.2.9 半乳糖凝集素-1 抗病毒能力分析
•     2.2.10 统计分析
• 3 结果
•   3.1 樱桃谷肉鸭半乳糖凝集素-1的组织分布情况
•     3.1.1 健康樱桃谷肉鸭体内半乳糖凝集素-1 的组织分布情况
•     3.1.2 感染鸭瘟病毒后樱桃谷肉鸭体内半乳糖凝集素-1 的表达情况
•   3.2 樱桃谷肉鸭半乳糖凝集素-1的克隆和鉴定
•   3.3 樱桃谷肉鸭半乳糖凝集素-1的进化树分析
•   3.4 半乳糖凝集素-1真核表达载体的构建
•   3.5 过表达半乳糖凝集素-1的鸭胚成纤维细胞所诱导的天然免疫反应
•     3.5.1 过表达duGal-1 后所诱导的ISGs和细胞因子表达量的变化
•     3.5.2 过表达duGal-1 后感染鸭瘟病毒诱导的ISGs和细胞因子表达量的变化
•   3.6 半乳糖凝集素-1的抗病毒能力分析
•   3.7 敲弱duGal-1 能够降低天然免疫相关细胞因子的表达量和抗病毒活性
•     3.7.1 敲弱duGal-1 后天然免疫相关细胞因子的表达量的变化
•     3.7.2 敲弱duGal-1 后抗病毒能力分析
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
•   1.duGal-1 核苷酸序列
•   2.duGal-1 氨基酸序列
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 韩少杰

导师: 柴同杰

关键词: 半乳糖凝集素,天然免疫应答,干扰,抗病毒,细胞因子

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 山东农业大学

基金: 国家自然科学基金面上项目【31470258】,2015.01-2018.12

分类号: S852.65

总页数: 67

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