金属蛋白酶ADAMTS18在中枢神经系统中的作用研究

论文摘要

ADAMTS（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs）是一类分泌型、多结构域、锌离子依赖型的细胞外基质金属蛋白酶。目前,已在人类中发现19个ADAMTS家族成员,分别由巨噬细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等合成并分泌。它们通过特定的蛋白质区域与细胞表面配基及细胞外基质（extracellular matrix,ECM）结合,通过剪切修饰ECM,在发育、组织重塑、炎症、生殖、肿瘤、血管发生及中枢神经系统（central nerves system,CNS）损伤等多种病生理过程中发挥重要作用。ADAMTS18是一种“孤儿金属蛋白酶”,于2002年通过对人类基因组数据库的广泛计算机筛选策略被首次发现,其功能和底物至今仍未明确。在人类胚胎中,ADAMTS18主要在肺、肝及肾组织表达;而在成人组织中,其主要在脑、前列腺、颌下腺、内皮及视网膜等组织表达。在小鼠中,Adamts18主要在脑、眼、肾、肺和睾丸等组织表达,在脑组织中表达量最高。2012年,研究者以72-74岁健康老年人为研究对象,对542050条单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms,SNPs）进行GWAS（genome-wide association study,GWAS）分析,初次发现ADAMTS18与脑白质的完整性相关,提示ADAMTS18可能会影响脑发育。然而,ADAMTS18在CNS中的具体作用仍亟待解决。经PubMed比对（PubMed blast）,小鼠Adamts18与人类ADAMTS18同源性高达88%,并且具有与人类相似的表达谱。本研究以实验室先前构建的Adamts18基因敲除小鼠（knock-out,KO）为模型,结合分子生物学、细胞生物学、组织病理学及动物行为学等方法,对ADAMTS18在CNS中的潜在作用进行了探究。研究方法包括:1)通过逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）及RNA原位杂交（in situ hybridization,ISH）等分子生物学方法对Adamts18在不同发育时期小鼠脑组织中的时空表达进行检测。2)通过苏木素-伊红染色（hematoxylin and eosin,H&E）、尼氏染色（Nissl staining）等形态学方法观察Adamts18缺失对小鼠脑解剖形态方面的影响。3)通过免疫荧光（immunofluorescence,IF）染色、高尔基染色（Golgi staining）等方法对比观察野生型（wild-type,WT）小鼠和Adamts18 KO小鼠脑中神经元的形态学特征。4)通过一系列动物行为学实验对两种基因型小鼠的脑功能进行评估。5)通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-Time-PCR,qRT-PCR）、酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）及蛋白免疫印迹（Western blotting）等分子生物学方法对ADAMTS18在CNS中的作用机制进行探究。实验结果显示:1)Adamts18 mRNA富集表达在小鼠脑发育阶段的多个脑区中,包括小脑、海马齿状回（dentate gyrus,DG）、大脑皮质、丘脑与上丘脑等,尤其是高表达在小脑的颗粒细胞层及海马DG区的内颗粒细胞层。2)相比WT小鼠,Adamts18 KO小鼠海马DG区的颗粒细胞展现出树突分支复杂性的增加及树突棘密度的增加[平均总树突长度:1110±91.02μm（KO）vs.870.3±65.64μm（WT）,*P<0.05;树突棘数目:9.919±0.285 per 10μm（KO）vs.8.811±0.372 per10μm（WT）,*P<0.05]。3)相比WT小鼠,Adamts18 KO小鼠在悬尾实验（Tail suspension test,TST）、强迫游泳实验（Forced swim test,FST）中表现出静止时间减少[TST:201±14.9 s（KO）vs.242±7.3 s（WT）,*P<0.05;FST:66±8.4 s（KO）vs.93±8.6 s（WT）,*P<0.05],在糖水偏好实验（Sucrose preference test,%）中则表现出糖水消耗增多[68±3.1%（KO）vs.57±2.8%（WT）,*P<0.05]。4)与WT小鼠相比,Adamts18 KO小鼠胚胎脑中层粘连蛋白（laminin,LN）的含量显著增加[LN:458.4±27.1 ng/mg（KO）vs.402±39.9 ng/mg（WT）,*P<0.05];Western blotting检测进一步发现Adamts18 KO小鼠胚胎脑中由LN介导的控制神经元极性的PI3K（PI3-kinase）/AKT/GSK-3β（glycogen synthasekinase-3β）/CRMP2（collapsin response mediator protein-2）信号通路被激活。综上所述,本研究使用Adamts18 KO小鼠作为模型,首次揭示了ADAMTS18在CNS中的作用:Adamts18缺失可导致小鼠胚胎脑中LN含量增加,激活由LN介导的PI3K/AKT/GSK-3β/CRMP2信号通路;该信号通路的激活可能与Adamts18KO小鼠海马DG区颗粒细胞树突分支及树突棘密度增加相关;树突结构可塑性的改变可能是造成Adamts18 KO小鼠抑郁样行为水平降低的原因之一。本研究不仅扩充了ADAMTS18的功能谱,而且为ADAMTS家族成员在CNS中的作用提供了新的证据。此外,ADAMTS18与抑郁样行为之间的关联也为临床上对抑郁样症状的诊断及治疗提供了新的思路。

论文目录

• 华东师范大学动物实验伦理委员会 动物实验伦理审查表
• 摘要
• abstract
• 缩略语清单
• 第一章 绪论
•   1.1 CNS中的ECM
•     1.1.1 CNS中 ECM的构成
•     1.1.2 层粘连蛋白（laminin,LN）
•   1.2 ADAMTS家族成员简介
•     1.2.1 ADAMTS家族成员的结构与分类
•     1.2.2 ADAMTS家族成员功能简介
•     1.2.3 ADAMTS家族成员在CNS中的作用
•   1.3 ADAMTS18在CNS中的研究现状
•     1.3.1 ADAMTS18简介
•     1.3.2 ADAMTS18在CNS中的研究背景
•   1.4 研究目的与主要研究内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验动物
•     2.1.2 实验仪器
•     2.1.3 实验试剂
•     2.1.4 实验耗材
•     2.1.5 常用试剂的配制
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 小鼠的繁育
•     2.2.2 基因型鉴定
•     2.2.3 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）
•     2.2.4 实时荧光定量PCR（q RT-PCR）
•     2.2.5 组织切片的制作
•     2.2.6 RNA原位杂交（ISH）
•     2.2.7 苏木素-伊红染色（H&E staining）
•     2.2.8 尼氏染色（Nissl staining）
•     2.2.9 免疫荧光染色（IF staining）
•     2.2.10 高尔基染色（Golgi staining）
•     2.2.11 树突形态分析
•     2.2.12 树突棘密度分析
•     2.2.13 动物行为学实验
•     2.2.14 蛋白含量检测
•     2.2.15 海马神经元的原代培养
•     2.2.16 数据统计分析
• 第三章 实验结果
•   3.1 Adamts18 mRNA主要表达在小鼠发育过程中的脑组织
•     3.1.1 Adamts18 mRNA在小鼠脑组织中的时间表达谱
•     3.1.2 Adamts18 mRNA在小鼠脑组织中的空间表达谱
•   3.2 Adamts18 缺失对小鼠脑组织解剖结构的影响
•   3.3 Adamts18 缺失影响小鼠海马齿状回区神经元的结构可塑性
•     3.3.1 Adamts18 缺失导致小鼠海马颗粒细胞树突复杂性增加
•     3.3.2 Adamts18 缺失导致小鼠海马颗粒细胞树突棘的密度增加
•   3.4 Adamts18 缺失对小鼠脑功能的影响
•     3.4.1 Adamts18 KO小鼠表现出自发性活动的增加
•     3.4.2 Adamts18 缺失对小鼠短期记忆的影响
•     3.4.3 Adamts18 缺失对小鼠短时工作记忆的影响
•     3.4.4 Adamts18 KO小鼠表现出空间学习记忆能力的轻微下降
•     3.4.5 Adamts18 缺失对小鼠焦虑水平的影响
•     3.4.6 Adamts18 KO小鼠表现出抑郁样行为水平的降低
•     3.4.7 Adamts18 缺失对小鼠社交能力的影响
•   3.5 Adamts18 缺失影响小鼠神经元结构可塑性的机制探究
•     3.5.1 Adamts18 缺失导致小鼠胚胎脑内LN含量升高
•     3.5.2 Adamts18 缺失激活LN/PI3K/AKT/GSK-3β/CRMP2信号通路
•   3.6 LN对海马神经元树突的影响
•   3.7 Adamts18 缺失影响小鼠胚胎脑内其它Adamts的转录水平
• 第四章 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附表1：靶基因的引物序列
• 附表2：本实验中所用到的一抗
• 附表3：Adamts18 KO小鼠行为学检测
• 个人简历
• Resume
• 学术期间科研成果
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 朱锐

导师: 张巍

关键词: 层粘连蛋白,树突结构可塑性,抑郁样行为

来源: 华东师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 华东师范大学

分类号: R338

总页数: 150

文件大小: 6734K

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