Shh信号在牙釉质发育早期功能的研究

论文摘要

Shh信号在胚胎发育中发挥重要作用,它是脊椎动物牙齿发育的标记物,调控口腔上皮-间充质的信号转导,同时促进早期牙胚的形态发生,并影响牙胚的细胞周期调控和分化,但Shh信号在牙釉质发育早期调控机制目前还不清楚。我们通过原位杂交实验发现Shh信号及其通路分子在刚出生小鼠的成釉质细胞中均有表达,但随着成釉质细胞进入分泌期,其表达逐渐降低并消失,表明Shh信号可能在分泌前的成釉质细胞中有作用。为了准确定义Shh信号在釉质发生过程中的功能,我们构建了由成釉质细胞特异的Amelx基因启动子驱动的、可诱导表达的Amelx-ERCreER小鼠,我们利用该小鼠在分泌前期的成釉质细胞中敲除Shh或Smo基因,都发现了釉质发育不全的表型。据此,我们推测Shh信号可能参与釉基质蛋白的合成或分泌。通过原位杂交和Q-PCR结果分析发现,在分泌前的成釉质细胞中敲除Shh基因会导致釉基质蛋白Amelogenin（Amelx）,Ameloblastin（Ambn）和Enamelin（Enam）基因表达显著下调,而且免疫荧光及Western blot实验都发现了釉基质蛋白显著减少,我们又通过体外器官培养,利用Shh重组蛋白激活Shh信号通路,Q-PCR实验结果显示Amelx,Ambn,Enam基因表达上调,以上结果表明Shh信号可能直接参与釉基质蛋白基因表达调控。为了验证我们的推测,我们利用成釉质细胞系ALC细胞,以及P2天野生型小鼠的磨牙上皮进行了ChIP分析,结果发现Gli1,Gli2,Gli3与Amelx,Ambn,Enam的启动子区域均有直接结合,其中Gli2的结合能力最强。为了确定Gli蛋白与Enam启动子的结合区域是否与我们预测的一致,我们又进行了Luciferase实验,结果显示,Gli与Enam启动子结合区域位于-600bp-1200bp。以上结果表明Shh信号主要是通过Gli直接调控釉基质蛋白基因的表达来参与釉质发生。

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1 引言

1.1 人与小鼠牙齿发育过程

1.2 Shh信号通路

1.2.1 Shh信号通路的组成

1.2.2 Shh信号对牙胚的形状影响

1.3 Shh信号对牙釉质形成影响研究状况

2 实验内容和设计

2.1 实验目的与意义

2.2 实验内容

2.3 实验流程图

3.实验试剂与方法

3.1 实验动物饲养与鉴定

3.1.1 实验小鼠的构建以及来源

3.1.2 实验小鼠基因型鉴定

3.2 实验材料处理

3.2.1 石蜡切片材料和处理

3.2.2 冰冻切片材料和处理

3.2.3 总RNA的提取和cDNA的制备

3.2.4 组织蛋白样品提取

3.2.5 细胞蛋白样品提取

3.2.6 原位杂交探针制备

3.3 实验方法

3.3.1 原位杂交

3.3.2 免疫荧光

3.3.3 HE染色（苏木精伊红染色）

3.3.4 Western blot（WB）

3.3.5 BrdU 细胞增殖实验

3.3.6 TUNEL检测细胞凋亡

3.3.7 器官体外培养（埋Beads）

3.3.8 染色质免疫共沉淀（ChIP）

3.3.9 双荧光素报告基因检测实验（Luciferase）

4 实验结果及分析

4.1 Amelx,Shh在小鼠磨牙成釉质细胞中时空表达

4.2 可诱导性表达的Amelx-ERCreER基因敲入小鼠的构建

4.3 Amelx-ERCreER基因敲入小鼠通过Tomaxifen药物诱导表达Cre重组酶

4.4 小鼠基因型鉴定

4.5 在牙釉质形成早期敲除Shh导致牙釉质无法形成

4.6 在牙釉质形成早期敲除Shh对成釉质细胞增殖和凋亡的影响

4.7 Shh信号对釉质形成相关基因的调控

4.8 Shh敲除导致牙釉质形成相关蛋白表达下调

4.9 转录因子Gli2与Amelx,Ambn,Enam结合影响牙釉质的形成

4.10 转录因子Gli家族与Enam结合影响釉蛋白的形成

5 总结与讨论

5.1 实验总结

5.2 讨论

参考文献

个人简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 许杰

导师: 张遵义,李建营

关键词: 信号,牙釉质发育不全,釉基质蛋白

来源: 杭州师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 杭州师范大学

分类号: Q344

总页数: 55

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