袁霞(通讯作者)张易青郭新建李占全崔森柴克霞冀林华
(青海大学附属医院青海西宁810001)
【摘要】目的了解VEGF、bFGF在慢性高原病（CMS）骨髓组织中的表达，探讨血管新生在CMS发生、发展中的作用。方法应用免疫组织化学SP法检测30例CMS患者（CMS组）及20例长期居住西宁地区健康人（对照组）骨髓组织中VEGF、bFGF的表达情况和MVD的变化（用CD34单抗标记的血管计数法）并进行比较分析。结果CMS组VEGF、bFGF阳性表达率分别为76.67%及73.33%，均显著高于对照组（分别为35.00%、30.00%）（p值均＜0.01）；CMS组MVD为33.23±6.13，也明显高于对照组（24.94±6.18）（p＜0.01）。CMS组VEGF阳性表达率、bFGF阳性表达率、MVD及Hb相互间均呈显著正相关（均为p＜0.01）。结论CMS骨髓组织中VEGF和bFGF表达升高,MVD增加，提示VEGF与bFGF协同促进血管生成和红细胞增殖，参与CMS的发生发展。
【关键词】慢性高原病血管内皮生长因子碱性成纤维生长因子微血管密度
【中图分类号】R594.3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）22-0027-03
慢性高原病（chronicmountainsickness,CMS）是长期生活在海拔2500米以上高原地区的世居者或移居者，对高原低氧环境逐渐失去习服而发生的临床综合征,又称Monge病，曾称高原红细胞增多症（highaltitudepolycythemia，HAPC），以红细胞过度增生、低氧血症为特征，常伴有肺动脉高压。长期以来，国内外学者对CMS进行了广泛研究，而且逐渐深入，其内容涉及形态学、代谢、造血细胞因子、细胞凋亡、缺氧诱导因子、凝血系统及血管新生等诸多方面。近年来血管新生在疾病中的作用愈来愈受到重视。血管形成过程的核心是血管内皮细胞的增殖。血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）是作用于血管内皮细胞的特异性有丝分裂原,通过旁分泌的方式与其受体VEGFR-1（flt-1）和VEGFR-2（KDR/flk-1）结合后，活化磷脂酞肌醇3激酶（phosphatidylinositol3-kinase,PI3K）,促进内皮细胞的增殖和血管形成。碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor,bFGF）是一类多肽生长因子,参与血管新生、胚胎发育等[1]。对新生血管形成过程中的毛细血管基底膜降解、内皮细胞增生和迁移、胶原合成、小血管腔形成等多个环节均有明显促进作用[2，3]。CD34是一种单链穿膜蛋白,现多用于标记血管内皮细胞。本实验对30例CMS和20例正常人骨髓组织VEGF、bFGF和CD34标记的微血管密度(MVD)进行了检测，旨在探讨血管新生在CMS发生发展的作用,从而为CMS的临床干预提供新靶点。
1材料与方法
1.1研究对象
30例CMS患者均为男性，按第六界国际高原医学和低氧生理学术大会推荐的慢性高原病诊断标准确诊[4]，平均年龄（43.80±8.42）岁。以20名西宁地区（海拔2260m）世居男性健康志愿者作为对照组，平均年龄（41.27±10.46）岁。研究对象均进行血常规、尿常规、心电图、X线胸透、肝功能及B超检查,排除各种急、慢性感染及原发性心、肺、肝、肾疾患和其他严重疾病。两组间年龄无统计学意义（p＞0.05）。见表1。
表1研究对象一般资料(x-±s)
1.2方法
所有患者均行骨髓活检术。骨髓标本均经过10%甲醛溶液固定,脱钙，石蜡包埋。VEGF及bFGF应用免疫组织化学SP法检测，MVD通过计数CD34单抗标记的血管内皮细胞检测。所应用的主要试剂包括：即用型鼠抗人VEGF免疫组化单克隆抗体，即用型鼠抗人bFGF免疫组化单克隆抗体，即用型鼠抗人CD34免疫组化单克隆抗体，即用型SP免疫组化染色试剂盒，即用型DAB试剂盒等均购自福建迈新生物技术开发有限公司。所有标本4μm厚连续切片。切片常规脱蜡行VEGF、bFGF和CD34的免疫组织化学SP染色。
1.3结果判定
所有染色切片均由两位富有经验的病理医生在同一条件下用Olympus光学显微镜采用双盲法阅片。
1.3.1VEGF和bFGF染色结果判定标准
VEGF和bFGF蛋白阳性表达为棕黄色颗粒,主要存在于细胞胞浆。为精确判断蛋白的表达程度及减少假阳性率,记分标准参照许良中等[5]的方法,随机选择10个高倍视野共记录1000个细胞,根据细胞浆的着色程度及着色细胞的百分率进行评分计算阳性系数：基本不着色者为0分,着色淡者为1分,着色适中者为2分,着色深者为3分。着色细胞占计数细胞百分率≤5%为0分,6%～25%为1分,26%～50%为2分,≥51%为3分。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分各自相乘,即为阳性系数。阳性系数为0,1分为（－）,2,3分为（＋）,4，6分为（＋＋）,如为9分为（＋＋＋）。
1.3.2CD34结果及MVD判定标准
采用抗CD34单克隆抗体标记血管内皮细胞，CD34定位于血管内皮细胞胞膜，棕染。计数单位面积中的微血管数目，即MVD，可由此来衡量血管生成的活跃程度。参照Weidner法[6]先在低倍镜(×100）下选取组织微血管数量最丰富的区域，然后在高倍镜（×400）视野范围计算3个视野血管的数目，取其平均值作为MVD。微血管判断不以红细胞的出现来确定是否是血管，也不以是否出现管腔来计数血管，凡染色呈棕色的单个内皮细胞或内皮细胞簇，只要它们和邻近的微血管或其他结缔组织分开，就视为一个微血管，只要结构不相连，其分支结构也作为一个血管计数。凡管腔大于8个红细胞大小、带有较厚肌层的血管均不计数。同法顺序计数多个高倍视野，取平均值，最终结果表示为每高倍视野平均微血管数。两人计数相差10%以上者重新计数。
1.4统计学处理:
VEGF及bFGF检测结果以阳性率表示，MVD值以均数士标准差(x-±s)表示。所有结果均应用统计软件SPSS16.0进行处理,VEGF和bFGF的阳性表达率比较采用Fisher精确概率分析,MVD比较采用独立样本t检验，VEGF阳性表达率、bFGF阳性表达率、MVD及Hb相互之间的相关性采用Spearman相关分析。
2结果
2.1VEGF、bFGF在骨髓组织中的表达和MVD检测结果
VEGF在CMS组23例表达阳性（76.67%），对照组7例表达阳性（35.00%），两组间差异具有显著性（p＜0.01）。bFGF在CMS组22例表达阳性（73.33%），对照组6例表达阳性（30.00%），两组间相比差异具有显著性（p＜0.01）。CMS组MVD为33.23±6.13，明显高于对照组（24.94±6.18）（p＜0.01）。见表2、3。
2.2相关性分析
CMS组VEGF阳性表达率、bFGF阳性表达率、MVD及Hb相互间均呈显著正相关（均为p＜0.01）
2.3.实验结果图片
3讨论
CMS是高原常见病,是以低氧代偿机制失调所致的以红细胞增多为显著特点的全身性损害疾病。一个细胞群体的大小取决于增殖与死亡两个因素,保持造血细胞群体的稳定也需保持增殖与死亡的动态平衡,任何一个方面过多过少都会引起病态。VEGF作为缺氧反应基因（HRGs）之一，其表达受上游的HIF-1调节[7]。HIF-1作为缺氧应答的全局性调控因子，缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子，主要受细胞内氧分压调节。当机体在高原环境下失代偿时，组织细胞内的氧分压明显降低，强烈刺激HIF-1的表达，进而上调VEGF表达，而当机体处于代偿状态时，组织细胞氧分压尚能维持在较高的水平，对HIF-1及VEGF表达的刺激弱。低氧条件下HRGs的激活除诱导细胞增殖外，由于VEGF表达增高[8,9]，同时可引起血管扩张和血管新生，使组织的血管密度增高[10-14]。一定程度的血管扩张和血管新生可增加局部组织的血液供应，改善局部组织的缺氧，达到代偿调节作用。但在慢性缺氧环境下，机体代偿不良时，过度表达VEGF，一方面可过度扩张组织血管，导致组织长期淤血，同时过分刺激血管新生，结果导致组织结构变化，反而影响组织的功能，导致病理状态。本研究发现CMS患者骨髓VEGF、MVD增加，且VEGF与MVD成正相关，提示VEGF在CMS的发生、发展中发挥着重要作用。同时因VEGF可调节造血干细胞和巨核细胞的生存、生长和分化，可影响造血系统。而低氧可刺激造血细胞产生VEGF，能分泌到骨髓微环境中调节骨髓基质细胞的功能。VEGF的过表达在一定程度上可刺激骨髓细胞的过度增殖。与血管新生一样，缺氧状态下细胞增生，也有两方面的影响。一方面可增加组织的整体功能，红细胞增加可增强携氧能力，有利于机体发挥代偿作用，适应低氧条件；另一方面过度的细胞积累可改变组织原有的正常形态、结构，使其重构，影响其功能，甚至发生失代偿，乃至病理状态。本研究发现VEGF与Hb成正相关，说明VEGF可在CMS的造血系统病理机制中发挥重要的调节作用。
bFGF是体内发现的最为有效的血管形成因子之一,它对新生血管形成过程中多个环节如毛细血管基底膜降解、内皮细胞迁移增生、胶原合成、小血管腔形成等均有明显促进作用[2，3]。颜金花等[15]在CMS患者中观察到的血浆和血清bFGF水平明显升高，本实验同样发现bFGF阳性表达率在CMS组和对照组分别为73.33%和30.00%,显示CMS骨髓组织中bFGF的表达显著高于正常人,此结果提示在机体对低氧环境处于失代偿时bFGF的表达明显增高,同时本研究发现CMS患者骨髓MVD增加，且bFGF与MVD成正相关，提示bFGF在CMS的血管新生的发生、发展中发挥着重要作用。骨髓腔中的静脉血窦系统是造血微环境的结构基础，内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、单核细胞、巨噬细胞等都是构成造血微环境的基质细胞[16]。bFGF、VEGF和PDGF水平的增高可能致使骨髓微血管密度增高,同时也作用于骨髓基质细胞,使其生成IL-6、G-CSF、GM-CSF等造血刺激因子增多，这些改变均有助于促使造血祖细胞增殖、分化。另外，有资料表明，bFGF、VEGF和PDGF均对造血有调节活性。bFGF是骨髓间质中的重要细胞因子[17]。有资料提示,FGF对造血过程具有促进作用[18-20]。这些资料均提示，bFGF、VEGF和PDGF除通过调节造血微环境间接刺激造血外，还可能直接调节造血细胞分化发育过程中的一些环节。本研究显示，骨髓bFGF水平与血红蛋白浓度之间呈正相关，提示在CMS患者中，增高的bFGF对CMS红细胞生成具有正性调节效应。
综上所述,CMS骨髓组织中,VEGF及bFGF表达上调,MVD增多,这与CMS临床病理特征和生物学行为密切相关,其表达间存在正相关关系。提示三者可能在CMS的发生发展过程中发挥协同作用,促进红细胞增殖和新生血管的生成。联合检测CMS中VEGF及bFGF的表达和MVD,有助于深入研究CMS血管新生的分子机制,为CMS的临床干预提供新的靶点。
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