猪流行性腹泻病毒PCR-ELISA检测方法的建立

论文摘要

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的一种急性、接触性肠道传染病,能够引起猪的腹泻、呕吐、脱水,对哺乳仔猪的致死率可达80%-100%。2010年以来,该病在我国暴发流行,给生猪养殖业造成了巨大的经济损失。目前,PEDV的防控主要包括病原监测、免疫防控、生物安全、加强畜群营养管理、临床诊断等综合措施,其中病原的的PCR-ELISA方法用以该病的早期监测。对GenBank公布的PEDV的ORF3基因序列,进行比对分析,针对保守序列设计合成一对RT-PCR特异性引物,通过PCR扩增获得PEDV ORF3目的基因片段,将其克隆至pMD19-T载体上,构建pMD19-T-ORF3重组质粒,质粒经PCR鉴定和测序,完成目的基因的鉴定。对该上下游引物的5’端分别标记地高辛和生物素,合成一对带有标记物的引物。以构建好的质粒为模板,用带有标记物的引物在相同条件下进行PCR扩增,得到两端带有标记物的PCR产物。按照PCR-ELISA的操作步骤对PCR-ELISA所用链霉亲和素的包被浓度、BSA封闭液的封闭浓度、PCR产物的作用时间、酶标二抗的工作稀释浓度以及作用时间、显色时间等进行优化,进而确定反应的最佳条件,取经PCR鉴定为PEDV阴性的35份样品,进行PCR-ELISA检测,测其OD450nm值,依据公式校正值=平均值（??）+3×标准方差（SD）确定PCR-ELISA检测方法的临界值。将PEDV的基因组cDNA进行倍比稀释,进行PCR-ELISA检测,确定其敏感性。以PRRSV、PRV、CSFV、PCV-2、猪乙型脑炎的DNA为模板,在最佳反应条件下进行PCR-ELISA检测其特异性。通过用不同的病料对同一时间包被的酶标板进行批内重复性检测和不同时间包被的酶标板进行批间重复性检测,确定该检测方法的重复性。通过与普通PCR检测和Q-PCR的检测结果比较其符合性。结果显示,常规PCR扩增出条带大小为227bp,经测序分析,与GenBank上发布的PEDV ORF3基因的同源性为100%,证明扩增的目的片段为PEDV ORF3基因。对PCR-ELISA各个试验条件进行优化,筛选出最佳反应条件:1:800稀释的链霉亲和素（1mg/mL）4℃包被过夜,2%的BSA封闭液37℃条件下封闭15min,1:50稀释的PCR产物37℃作用15min,2000倍稀释的酶标二抗（1mg/mL）37℃反应15min,显色5min。将已知PEDV阴性的35份样品,经PCR-ELIAS检测,样本OD450nm值大于等于0.35的判定为阳性,小于0.29判定为阴性,介于二者之间为可疑样品。本试验建立的PCR-ELISA可检测到阳性质粒的最低检测限3.94×103copies/μL,而常规PCR可以检测到的最低限为3.94×106copies/μL,由结果可以看出,PCR-ELISA敏感性比常规PCR高1000倍,并与PRRSV、PRV、CSFV、PCV-2、猪乙型脑炎无交叉反应,说明其特异性好。对64份临床样品进行检测,PCR检测出31份阳性,阳性检出率为48.4%,PCR-ELISA检测出36份阳性样品,阳性检出率为56.2%,Q-PCR检测出36份阳性。将PCR鉴定为阴性PCR-ELISA和Q-PCR检测为阳性的5份样品进行病毒分离培养、IFA鉴定,结果均为阳性,说明建立的PCR-ELISA检测方法准确度高,与荧光定量PCR的符合率为100%。总之,本试验建立了一种高效、快速、特异、灵敏、安全的PEDV检测方法,为进一步组装试剂盒或研制试纸条用于PEDV的流行病学调查、猪场的环境监测以及诊断提供技术支撑。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词
• 第一章 文献综述
•   1.PED的概述
•   2.PED的流行病学
•   3.PEDV的病原学特征
•     3.1 PEDV的形态结构及理化特性
•     3.2 病毒蛋白功能
•   4.PED的诊断以及防治
•     4.1 诊断方法
•     4.2 PED的防治
•   5.PCR-ELISA
•     5.1 PCR-ELISA技术简介
•     5.2 PCR-ELISA的分类
•     5.3 PCR-ELISA的应用
•     5.4 PCR-ELISA技术的最新进展
• 引言
• 第二章 猪流行性腹泻病毒PCR-ELISA的建立
•   1.材料
•     1.1 病毒来源
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要试剂的配制
•     1.4 主要仪器和设备
•   2.方法
•     2.1 猪流行性腹泻病毒ORF3 基因的鉴定
•     2.2 猪流行性腹泻病毒PCR-ELISA检测方法的建立
•   3 结果
•     3.1 RT-PCR扩增结果
•     3.2 重组质粒的鉴定
•     3.3 测序结果分析
•     3.4 PCR-ELISA的建立
•   4.讨论
• 第三章 PCR-ELISA符合性试验
•   1.材料
•     1.1 试验材料
•     1.2 试验试剂以及仪器
•   2.方法
•     2.1 SYBR GreenⅡ荧光定量PCR检测
•     2.2 临床样品的检测
•     2.3 病毒的分离
•     2.4 病毒液RT-PCR
•     2.5 间接免疫荧光试验
•   3.结果
•     3.1 SYBR GreenⅡ荧光定量PCR方法
•     3.2 临床样品检测
•     3.3 病毒分离结果
•     3.4 病毒液RT-PCR
•     3.5 IFA结果
•   4 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间科研成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 朱红晓

导师: 刘兴友

关键词: 猪流行性腹泻病毒,荧光定量

来源: 河南科技学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河南科技学院

基金: 2016年国家重点研发计划(2016YFD0500702),河南省生猪产业体系(S2012-06-G02),河南省科技开放合作项目(182106000043)

分类号: S852.651

总页数: 76

文件大小: 2536K

下载量: 250