黑曲霉M00988菌株来源的降解赭曲霉毒素A羧肽酶基因的原核表达及其固定化

论文摘要

黑曲霉M00988菌株具有降解赭曲霉毒素A（OTA）的作用。为了提高天然菌株的降解效率,将黑曲霉菌株中解毒的关键羧肽酶cp基因进行克隆,并原核重组表达该酶。通过优化得到最优的表达条件为培养2.5 h后加入1 mmol/L IPTG,诱导温度28℃,诱导时间20 h。粗酶液经镍柱纯化后得到解毒能力达30.03μg/mg的电泳级重组羧肽酶。之后,采用AB-8大孔树脂作为吸附载体,戊二醛为交联剂对酶进行复合固定化,得到最优固定化条件为吸附时间12 h、吸附温度37℃、戊二醛质量分数0.35%、交联时间1 h、交联温度25℃。固定化酶与游离酶相比,酶对底物的亲和力虽有所下降,但酶促反应最大速度（Vmax）没有显著下降,催化效率基本一致,表明对该酶进行吸附-交联复合固定化效果良好。对固定化前、后酶的二级结构的研究表明:酶经固定化后,α螺旋和无规则卷曲的含量有所上升,β折叠显著下降,β转角变化不明显。这说明酶经固定化后,部分β折叠链内氢键断裂,转变成为无规则结构或α螺旋结构,导致固定化酶对底物的亲和力较之前有所下降,而其Vmax与游离态酶基本一致,因此固定化酶与游离态酶的催化效率基本一致。本研究为羧肽酶降解OTA在工业上的固定化应用奠定了基础。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 菌株及主要试剂
•     1.1.2 主要仪器、设备
•   1.2 方法
•     1.2.1 构建重组质粒pET28a-cp
•     1.2.2 解毒能力测定
•     1.2.3 重组羧肽酶的表达及诱导条件优化
•     1.2.4 重组羧肽酶的纯化
•     1.2.5 重组酶的固定化研究
•       1.2.5. 1 固定化载体及活化方式的选择
•       1.2.5. 2 固定化条件的优化
•       1.2.5. 3 固定化酶动力学参数测定
•       1.2.5. 4 固定化酶结构的初步探究
• 2 结果与分析
•   2.1 重组质粒pET28a-cp的构建
•   2.2 羧肽酶全长生物信息学分析
•   2.3 重组羧肽酶的表达及条件优化
•     2.3.1 重组羧肽酶的表达
•     2.3.2 诱导条件优化
•   2.4 重组羧肽酶的纯化
•   2.5 重组羧肽酶的固定化
•     2.5.1 固定化载体的选择及固定化条件的优化
•     2.5.2 固定化酶动力学参数变化
•     2.5.3 固定化对重组酶结构的影响
• 3 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 熊科,支慧伟,王小艺,赵峙尧,柳佳芸,裴鹏刚,邓蕾,李秀婷

关键词: 羧肽酶,重组表达,酶复合固定化

来源: 中国食品学报 2019年05期

年度: 2019

分类: 工程科技Ⅰ辑,基础科学

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 北京工商大学北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京工商大学北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京工商大学北京市质量与安全重点实验室,北京工商大学北京市风味化学重点实验室

基金: 国家重点研发计划项目(2017YFC1600605),北京自然科学基金项目(6172003),国家自然科学基金项目(31601408)

分类号: TS201.3

DOI: 10.16429/j.1009-7848.2019.05.010

页码: 66-75

总页数: 10

文件大小: 2546K

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