拟南芥转录因子MYB59调控低钾条件下K+/NO3-转运的分子机制研究

论文摘要

钾和氮是植物生长发育所必需的大量元素,直接影响植物的生长发育以及作物的产量和品质。K+在酶促反应、渗透调节、电荷平衡等方面都起着重要的作用,而N则是碳化合物的组成成分,构成了氨基酸、蛋白质、核苷酸等物质。农作物生产实践表明,钾和氮的吸收和转运是协同进行的,但其分子调控机制仍不明确。实验室前期研究发现,拟南芥硝酸根转运体NRT1.5不仅负责NO3-从根向冠的转运,同时还影响K+从根部向冠部的运输过程。因此,NRT1.5很可能是钾和氮协同运输的重要组分。已有研究表明钾缺乏抑制NRT1.5的转录,说明NRT1.5的转录能够响应环境中钾浓度变化,但低钾抑制NRT1.5转录的调控机制尚属未知。本论文工作证明了 MYB59是NRT1.5的正向转录调控因子,低钾可通过抑制MYB59的转录及促进MYB59蛋白的降解进而抑制NRT1.5的转录,最终调节拟南芥中钾和氮的协同转运过程。通过表型筛选获得一个拟南芥低钾敏感突变体lks3。在低钾条件下lks3表现出冠部比野生型提前发黄的表型,图位克隆及表型检测结果显示LKS3编码转录因子蛋白MYB59。myb59突变体表现出和lks3类似的低钾敏感表型,且myb59的回补材料能将其低钾敏感表型恢复至野生型水平,说明myb59的低钾敏感表型是由MYB59基因的突变引起的。MYB59在拟南芥体内存在保守的可变剪切,其中最长的转录本MYB59.3能够恢复myb59突变体的低钾敏感表型,说明MYB59.3在低钾响应过程中发挥主要作用。离子含量测定结果显示,低钾条件下myb59突变体的根部积累了更多的K+和NO3-,而冠部的K+和NO3-含量降低,说明MYB59调控K+和NO3-从根向冠的转运过程。RNA-seq和Rea1-time PCR结果显示myb59突变体中1NRT1.5的转录水平显著降低,说明MYB59正调控NRT1.5的转录。myb59和nrt1.5突变体表型相似,对低钾的敏感程度较为一致,而且它们在K+和N03-从根向冠的转运上都存在缺陷。myb59 nrt1.5双突变体的低钾表型及钾含量与nrt1.5突变体一致,说明MYB59和NRT1.5在低钾响应过程中处于同一通路。此外,pPHO1:NRT1.5能够回补nrt1.5和myb59的低钾敏感表型,说明MYB59位于NRT1.5的上游。分析表明NRT1.5的启动子上存在MYB59的结合元件,ChIP及EMSA实验分别从体内和体外证明MYB59.3蛋白可以直接结合在NRT1.5的启动子区域。实验结果还表明,低钾处理可以同时抑制MYB59及NRT1.5的转录水平。而半体内蛋白降解实验结果表明,低钾处理后MYB59.3蛋白被快速降解。本论文研究结果表明,MYB59是NRT1.5的正向转录调节因子。在正常钾条件下,MYB59促进NRT1.5的转录,进而促进拟南芥中K+和NO3-从根向冠的协同运输过程。低钾胁迫时,MYB59的转录水平和蛋白水平均被下调,结果使NRT1.5的转录被抑制,K+和NO3-从根向冠的协同转运也随之受抑。论文研究工作证明了 MYB59和NRT1.5这一转录调控通路在植物响应环境钾亏缺、调控钾/氮协同转运及根冠分配方面有重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩写
• 第一章 文献综述
•   1.1 钾在植物生长发育中的生理功能
•     1.1.1 钾在植物体内的分布
•     1.1.2 植物体内钾的生理功能
•     1.1.3 植物缺钾症状
•     1.1.4 植物中钾的吸收和转运机制
•     1.1.5 钾通道和钾转运体的调控机制
•   1.2 氮在植物生长发育中的生理功能
•     1.2.1 植物体内氮的生理功能
•     1.2.2 植物缺氮或氮肥过量的症状
• 3^-的吸收和转运机制'>    1.2.3 植物中NO₃^-的吸收和转运机制
•   1.3 植物体内钾和氮吸收利用的相互影响
•   1.4 MYB转录因子对植物响应的调控
•     1.4.1 MYB转录因子的结构
•     1.4.2 MYB转录因子的功能
•     1.4.3 MYB59的研究进展
•   1.5 本研究工作的立题依据和意义
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 常用菌株
•     2.1.3 常用载体
•     2.1.4 常用实验仪器
•     2.1.5 常用试剂
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 拟南芥的培养与种植
•     2.2.2 遗传分析及图位克隆
•     2.2.3 T-DNA插入纯合突变体的鉴定
•     2.2.4 转基因材料的获得及筛选
• +和NO₃^-含量的测定'>    2.2.5 K⁺和NO₃^-含量的测定
• 86Rb⁺同位素吸收实验'>    2.2.6⁸⁶Rb⁺同位素吸收实验
•     2.2.7 分子克隆与载体构建
•     2.2.8 目的基因转录水平表达分析
•     2.2.9 酵母相关实验方法
•     2.2.10 原核蛋白的诱导表达及纯化（His-tag融合蛋白）
•     2.2.11 SDS-PAGE及Western Blot
•     2.2.12 凝胶阻滞实验（EMSA）
•     2.2.13 染色质免疫共沉淀实验（ChIP）
•     2.2.14 半体内Cell-Free降解实验
•   2.3 实验所用引物
• 第三章 实验结果及分析
•   引言
•   3.1 lks3突变体具有低钾敏感表型
•     3.1.1 lks3突变体的获得及鉴定
• +含量的测定'>    3.1.2 lks3突变体K⁺含量的测定
•   3.2 LKS3编码转录因子蛋白MYB59
•     3.2.1 基因At1g70390其它T-DNA插入突变体的鉴定与表型
•     3.2.2 基因At1g70390回补lks3材料的鉴定与表型
•     3.2.3 TAIL-PCR寻找引起lks3低钾敏感表型的目的基因
•     3.2.4 图位克隆寻找引起lks3低钾敏感表型的目的基因
• +和NO₃^-从根向冠的转运'>  3.3 MYB59参与拟南芥K⁺和NO₃^-从根向冠的转运
•     3.3.1 myb59突变体及回补材料表型观察
• +含量及NO₃^-含量测定'>    3.3.2 myb59突变体及回补材料K⁺含量及NO₃^-含量测定
• +含量及NO₃^-含量测定'>    3.3.3 myb59突变体及回补材料木质部伤流液中K⁺含量及NO₃^-含量测定
•     3.3.4 myb59各转录本回补材料表型观察
•     3.3.5 MYB59特异地参与钾营养胁迫的调控过程
•   3.4 MYB59作为转录因子正向调控NRT1.5基因的表达
•     3.4.1 MYB59具有转录激活活性
•     3.4.2 myb59突变体及回补材料中NRT1.5基因的表达检测
•     3.4.3 MYB59和NRT1.5的表达部位部分重叠
•     3.4.4 观察pNRT1.5:GUS转基因材料组织染色的强弱
•     3.4.5 观察pNRT1.5:NRT1.5-GFP转基因材料GFP荧光的强弱
•   3.5 MYB59.3与NRT1.5的启动子直接结合
•     3.5.1 ChIP-qPCR实验验证MYB59.3在体内直接结合NRT1.5的启动子
•     3.5.2 EMSA实验验证MYB59.3在体外直接结合NRT1.5的启动子
•   3.6 NRT1.5是MYB59的遗传上位基因
•     3.6.1 myb59和nrt1.5突变体对低钾的敏感程度较为一致
•     3.6.2 MYB59和NRT1.5在低钾响应过程中处于同一通路
•     3.6.3 MYB59和NRT1.5的遗传关系研究
•   3.7 MYB59和NRT1.5对低钾的响应
•     3.7.1 MYB59总RNA和NRT1.5对低钾的响应
•     3.7.2 MYB59各转录本对低钾的响应
•     3.7.3 MYB59.3蛋白对低钾的响应
• 第四章 讨论
• +/NO₃^-的转运过程中起着重要作用'>  4.1 MYB59和NRT1.5在K⁺/NO₃^-的转运过程中起着重要作用
•   4.2 MYB59存在可变剪切
•   4.3 MYB59存在转录后修饰
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 杜心桥

导师: 武维华,王毅

关键词: 转录调控,转运

来源: 中国农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 中国农业大学

分类号: Q943.2

总页数: 144

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