一、表皮葡萄球菌感染与生物膜形成（论文文献综述）
刘姝灵[1]（2021）在《肺炎克雷伯菌胞外多糖广谱抗生物膜活性研究》文中研究说明
孟媛媛[2]（2021）在《VraSR调控表皮葡萄球菌生物膜形成及药物敏感性的分子机制研究》文中进行了进一步梳理目的本课题选取双组分信号转导系统VraSR为切入点,探索VraSR调控表皮葡萄球菌生物膜形成及药物敏感性的分子机制,旨在为临床控制表皮葡萄球菌引起的感染提供理论依据及发现潜在的药物靶标。方法1.表皮葡萄球菌vraSR互补突变株的构建:以表皮葡萄球菌临床分离株（Staphylococcus epidermidis strain 1457,SE1457）基因组DNA为模板,PCR扩增vraSR基因,酶切后连接至载体p CN51质粒,连接产物转化大肠杆菌。重组质粒p CN51-vraSR经PCR、酶切和测序鉴定正确后电击转化至金黄色葡萄球菌RN4220,再转入表皮葡萄球菌SE1457 vraSR敲除突变株（ΔvraSR）中,获得vraSR互补突变株ΔvraSR（p CN51-vraSR）。同时,以空质粒p CN51为对照,构建空载对照株ΔvraSR（p CN51）。表皮葡萄球菌SE1457 vraSR敲除突变株（ΔvraSR）是利用质粒p KORI在野生株SE1457基础上通过同源重组技术获得的,由本实验室保存。2.表皮葡萄球菌生物表型实验:利用微量平板半定量法检测表皮葡萄球菌SE1457及其同源性vraSR突变株生物膜形成能力,试管稀释法检测表皮葡萄球菌的药物敏感性;菌落计数（CFU）检测表皮葡萄球菌的存活及对环境压力（万古霉素、SDS、H2O2、Triton X-100）的耐受性。通过Triton X-100诱导的自溶实验及qRT-PCR定量检测表皮葡萄球菌生物膜基质中胞外DNA（e DNA）释放量,分析ΔvraSR突变株生物膜降低的原因。刚果红吸收实验以及透射电镜观察细菌细胞壁形态进一步探索表皮葡萄球菌SE1457及其同源性vraSR突变株细胞壁的完整性;通过观察细菌在不同时间（24h、48h、72h、96h）和不同浓度（50μg/m L、100μg/m L、200μg/m L、400μg/m L）的刚果红平板上吸收刚果红的能力可以检测细菌细胞壁的通透性。3.VraSR调控表皮葡萄球菌生物膜形成及药物敏感性的分子机制探索:对数生长期细菌经环境胁迫因子（万古霉素、氨苄青霉素、氯霉素、H2O2、SDS）处理30min,抽取表皮葡萄球菌SE1457及vraSR敲除突变株RNA样品,采用qRT-PCR分析表皮葡萄球菌SE1457vra S/vra R转录水平变化,以探索VraSR可能感应的环境胁迫因子;转录组测序（RNA-seq）分析表皮葡萄球菌SE1457及ΔvraSR突变株的差异表达基因,结合SE1457与ΔvraSR突变株的表型差异,对受VraSR调控的疑似靶基因（与生物膜形成及药物敏感性相关的基因）进行qRT-PCR验证。Ni-NTA柱层析纯化表皮葡萄球菌SE1457重组融合蛋白VraR（His6-VraR）,利用凝胶阻滞实验（EMSA）分析反应调节蛋白VraR与疑似靶基因启动子区之间的相互作用。结果1.PCR及测序结果显示重组质粒p CN51-vraSR构建成功,qRT-PCR提示ΔvraSR（p CN51-vraSR）互补突变株中vraSR转录水平是SE1457野生株的1.8倍。2.敲除vraSR对表皮葡萄球菌生物学表型的影响:（1）通过微量平板半定量法检测表皮葡萄球菌生物膜形成情况,SE1457野生株在6h、12h、24h、48h生物膜的形成量(OD570)分别为1.74±0.10、2.45±0.20、2.74±0.11和2.82±0.15;ΔvraSR突变株生物膜的形成量较SE1457野生株显着降低（P<0.01）,在上述4个观察时间点ΔvraSR突变株生物膜的形成量(OD570)分别为0.81±0.07、1.22±0.1、1.71±0.05和1.76±0.10;ΔvraSR（p CN51-vraSR）互补突变株生物膜的形成量接近SE1457野生株水平,在上述4个观察时间点ΔvraSR（p CN51-vraSR）互补突变株生物膜的形成量(OD570)分别为1.36±0.06、1.80±0.04、2.31±0.17和2.79±0.09;ΔvraSR（p CN51）空载株生物膜形成量与ΔvraSR突变株类似。qRT-PCR定量检测表皮葡萄球菌生物膜基质中胞外DNA（e DNA）释放量(ng/OD600),结果显示ΔvraSR突变株和ΔvraSR（p CN51）空载株24小时生物膜中的e DNA的相对浓度比SE1457野生株和ΔvraSR（p CN51-vraSR）互补株高2倍。（2）试管稀释法检测表皮葡萄球菌SE1457及其同源性vraSR敲除突变株的药物敏感性,结果显示SE1457野生株对万古霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素的敏感性（MIC值）分别为4μg/m L、0.5μg/m L、8μg/m L和8μg/m L;ΔvraSR突变株对上述4种抗生素的敏感性（MIC值）分别为1μg/m L、0.25μg/m L、8μg/m L和8μg/m L;ΔvraSR突变株对作用于细胞壁抗生素（万古霉素与氨苄青霉素）的药物敏感性（MIC值）较SE1457野生株显着增高,对卡那霉素和氯霉素的敏感性两者无显着差异。将p CN51-vraSR互补至ΔvraSR突变株后能回复其对万古霉素和氨苄青霉素的药物敏感性,ΔvraSR（p CN51-vraSR）互补突变株对上述4种抗生素的敏感性（MIC值）分别为4μg/m L、0.5μg/m L、8μg/m L和8μg/m L;然而,电击转化p CN51空载质粒对ΔvraSR突变株药物敏感性无影响,ΔvraSR（p CN51）空载对照株对上述4种抗生素的敏感性（MIC值）分别为1μg/m L、0.25μg/m L、8μg/m L和8μg/m L。（3）分光光度计(OD600)测定表皮葡萄球菌生长曲线,SE1457野生株与ΔvraSR突变株生长无明显差异。菌落计数（CFU）检测表皮葡萄球菌的存活及对环境压力（万古霉素、SDS、H2O2、Triton X-100）的耐受性。结果显示,在振荡培养8h、12h、24h、48h后表皮葡萄球菌SE1457野生株CFU计数分别为1.52×109、2.19×109、3.23×109、3.18×109;ΔvraSR突变株CFU计数分别为1.19×109、1.02×109、5.6×108、1.21×108;ΔvraSR突变株活菌数（CFU）明显低于SE1457野生株（P<0.05）。采用菌落计数（CFU）分析表皮葡萄球菌对环境压力（万古霉素、SDS、H2O2、Triton X-100）的耐受性,结果显示表皮葡萄球菌分别在万古霉素压力下暴露72h、在阴离子去垢剂SDS压力下暴露48h以及Triton X-100压力下暴露48h后,ΔvraSR突变株的耐受性显着降低,并且未检测到活菌,SE1457野生株与ΔvraSR突变株对氧化压力H2O2的耐受性无显着差异。通过Triton X-100诱导细菌自溶的方法检测表皮葡萄球菌SE1457及ΔvraSR突变株自溶的差异,结果显示SE1457野生株在振荡3h后自溶率为34%,ΔvraSR突变株在振荡3h后自溶率为74%,ΔvraSR突变株的自溶率显着高于SE1457野生株。刚果红吸收实验检测SE1457野生株与ΔvraSR突变株细胞壁的完整性,结果显示随着培养时间和刚果红浓度的增加,与SE1457野生株相比,ΔvraSR菌落中央较红,吸收刚果红量增加。透射电镜观察培养至稳定期的SE1457野生株、ΔvraSR突变株以及ΔvraSR（p CN51-vraSR）互补株的细胞壁形态并测量细菌细胞壁厚度,结果显示与SE1457野生株相比,ΔvraSR突变株细胞壁表面较粗糙,细胞壁有间断情况;SE1457野生株细胞壁厚度为37.93±7.2μm、ΔvraSR突变株细胞壁厚度为29.79±2.8μm（P<0.01）、ΔvraSR（p CN51-vraSR）互补株细胞壁厚度为35.04±4.52μm;ΔvraSR（p CN51-vraSR）互补株的表型均回复至野生株水平,ΔvraSR（p CN51）空载对照株的表型均与ΔvraSR突变株类似。3.VraSR调控表皮葡萄球菌生物膜形成及药物敏感性的分子机制探索:（1）qRT-PCR分析表皮葡萄球菌SE1457 vraSR在环境胁迫因子作用下的转录水平。结果显示,在10倍MIC浓度万古霉素和氨苄青霉素作用下,vraSR转录水平上调约4.8倍和7.2倍;在阴离子去垢剂SDS作用下,vraSR转录水平上调约7倍。然而,在氯霉素、氧化压力（H2O2）、热（42℃、45℃）和高渗（1.5%Na Cl）作用下,vraSR转录水平没有明显改变。结果提示VraSR选择性对作用于细胞壁的抗生素（万古霉素、氨苄青霉素）及SDS有反应,VraSR可能在表皮葡萄球菌适应外界环境压力中发挥作用。（2）转录组测序（RNA-seq）分析表皮葡萄球菌SE1457及ΔvraSR突变株的差异表达基因,结果发现共有314个差异表达基因,其中有249个基因表达水平上调、65个基因表达下调。qRT-PCR验证结果显示,?vraSR突变株中与生物膜形成相关的基因ica A转录水平下调约2倍,ica R上调约4倍;与药物耐受性相关的基因lrg A转录水平下调约10倍、cid A上调约2倍,与糖代谢相关的基因gnt K下调约10倍、glp D下调约2倍;与磷酸戊糖途径相关的基因sdh A上调约2倍;而直接与葡萄球菌耐药有关基因,如糖基转移酶基因（stg B）、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖1-羧乙烯基转移酶1基因（mur AA）、UDP-N-乙酰壁氨酰丙烯酰胺-D-谷氨酸-2%2C6-二氨基甲酸连接酶基因（mur E）、青霉素结合蛋白基因（pbp2）的转录水平无明显改变,提示VraSR不直接调控表皮葡萄球菌的药物敏感性。（3）凝胶阻滞实验（EMSA）分析表皮葡萄球菌反应调节蛋白VraR与疑似靶基因启动子区之间的相互作用。凝胶阻滞实验（EMSA）证明了磷酸化的VraR-P蛋白能与vraSR、ica、lrg AB、cid A基因的启动子区结合,VraR-P不能与pbp2、stg B、mur E、mur AA基因的启动子区结合。结论表皮葡萄球菌VraSR存在自我调控机制,能选择性对细胞壁胁迫因子有反应;VraSR通过调控ica操纵子的转录促进表皮葡萄球菌生物膜形成,并通过调控Cid A-Lrg A系统增强表皮葡萄球菌在环境胁迫因子下的存活,进而间接影响表皮葡萄球菌对作用细胞壁抗生素（万古霉素、氨苄青霉素）的药物敏感性。
占晴[3]（2021）在《亚抑菌浓度的莫匹罗星促进表皮葡萄球菌生物膜的形成及其作用机制》文中指出研究目的表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis,SE）是人类和哺乳动物皮肤和粘膜常见的共生细菌。然而由于各种侵入性的治疗手段,例如骨科植入物、导尿管、心脏瓣膜、分流器等医疗设备（MDs）的大量应用以及免疫力低下的患者在医院内的获得性感染,导致表皮葡萄球菌引起的感染不断增多。表皮葡萄球菌能在各种医疗相关植入设备上形成有效适应机体微环境并且抵御抗菌药物渗透的生物膜。由于全球范围内广谱抗菌药物的过度使用,表皮葡萄球菌对抗菌药物的耐药率呈现不断上升的趋势,导致临床可选择使用的抗菌药物逐渐受到限制。莫匹罗星是荧光假单胞菌发酵的产物,已被广泛应用于耐药葡萄球菌的去定植,可显着减少葡萄球菌血流感染的发生率。已有部分研究表明部分亚抑菌浓度的抗菌药物能促进细菌的生物膜形成能力。我们之前的研究表明亚抑菌浓度的莫匹罗星可能会通过上调cidA基因增强金黄色葡萄球菌的生物膜。在此项工作中,我们专注于研究亚抑菌浓度的莫匹罗星对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响和作用机制。研究方法1.根据2020年美国临床实验室标准化协会（CLSI）制定的方法,我们用微量肉汤稀释法确定表皮葡萄球菌1457（SE1457）、表皮葡萄球菌ATCC35984和表皮葡萄球菌ATCC12228的莫匹罗星的最低抑菌浓度（MIC）,并从温州医科大学附属第一医院来自不同患者分离的60株表皮葡萄球菌中挑选了生物膜弱阳性的两株莫匹罗星耐药株（SE157和SE158）和两株莫匹罗星敏感株（SE258和SE274）。2.采用自动生长曲线检测仪（Biocreen C,Finland）测定600nm波长下的OD值,测定表皮葡萄球菌在亚抑菌浓度莫匹罗星作用下的生长曲线。3.将不同浓度的莫匹罗星与表皮葡萄球菌共同培养,在96孔聚苯乙烯微量滴定板中、刚果红平板上和激光共聚焦显微镜（CLSM）评估SE1457和SE157、SE158、SE258和SE274的生物膜形成情况。4.通过菌落计数法和玻片染色观察比较了莫匹罗星加药组和不加组的初始黏附期及成熟期的差别,细菌的疏水性实验（MATH）和细菌代谢活性测定比较亚抑菌浓度的莫匹罗星对表皮葡萄球菌生物膜的疏水和代谢活性的影响。5.通过由Triton X-100诱导的莫匹罗星加药组和不加莫匹罗星组的细菌生长的自溶实验,细胞外DNA（eDNA）的提取确定莫匹罗星是否促进细菌的自溶、细胞外DNA（eDNA）的释放。将DNaseⅠ（DNA酶）加入96孔聚苯乙烯微量滴定板中,观察在亚抑菌浓度莫匹罗星作用下、加DNaseI组和不加DNaseI组的表皮葡萄球生物膜形成能力。6.通过印迹法测定莫匹罗星加药组和不加莫匹罗星组的细菌生物膜中的多糖细胞间粘附素（PIA）的差异。7.通过转录组数据和RT-PCR进行分析和验证并确定莫匹罗星对表皮葡萄球菌生物膜的作用靶点。8.确定靶点基因后对表皮葡萄球菌进行基因编辑,在敲除株中将靶点基因atlE进行回补。然后再次评估△atlE敲除株、atlE回补株和1457野生株的生物膜的发育形成、自溶和eDNA产生的情况。研究结果1.SE1457、ATCC12228 和 ATCC35984 的莫匹罗星 MIC 均为 0.015625μg/mL,SE258和SE274的莫匹罗星MIC为0.0625μg/mL,均为莫匹罗星敏感菌株。SE157和SE158的莫匹罗星MIC分别为256μg/mL和128μg/mL,为莫匹罗星耐药菌株。2.将莫匹罗星加药组与不加药组加入到96孔板聚苯乙烯微量滴定板中,发现亚抑菌浓度的莫匹罗星可以显着增强生物膜弱阳性的表皮葡萄球菌,而对完全阴性的表皮葡萄球菌ATCC12228没有促进作用。刚果红平板上可以看到莫匹罗星作用后表皮葡萄球菌菌落在平板上变黑,激光共聚焦荧光显微镜（CLSM）进一步显示了莫匹罗星作用下的表皮葡萄球菌生物膜比未加药组的表皮葡萄球菌生物膜中活菌数量显着增多,生物膜紧密。3.通过c.f.u计数和玻片染色观察亚抑菌浓度莫匹罗星作用下的表皮葡萄球菌生物膜的初始黏附能力显着高于未加药组。4.亚抑菌浓度莫匹罗星作用下的表皮葡萄球菌的疏水能力无明显变化,但是细菌代谢活性比未加药组更低。5.亚抑菌浓度莫匹罗星作用下的表皮葡萄球菌生物膜中eDNA的含量显着高于未加药组,且在Triton X-100诱导下的自溶能力也高于未加药组。加入DNaseI后,亚抑菌浓度的莫匹罗星增强表皮葡萄球菌生物膜的能力相较于未加DNaseI的表皮葡萄球菌生物膜的能力显着减弱。亚抑菌浓度莫匹罗星处理组与对照组生物膜之间的多糖细胞间粘附素（PIA）的差异并无统计学意义。这说明莫匹罗星可能通过促进表皮葡萄球菌自溶和eDNA的释放来促进其生物膜形成,而不是通过PIA途径。6.通过RT-PCR进行RNA-Seq数据分析和验证后,发现亚抑菌浓度的莫匹罗星能够显着上调atlE,、cidA等自溶基因的表达,下调lrgAB的表达。通过分析atlE为上调最为显着的基因,可能是莫匹罗星作用的靶点。接下来我们发现亚抑菌浓度的莫匹罗星不能增强atlE敲除株的生物膜形成能力,我们通过构建atlE的回补株,发现回补株在亚抑菌浓度莫匹罗星作用下可以恢复一部分到SE1457野生株水平。结论1.亚抑菌浓度的莫匹罗星能够显着促进表皮葡萄球菌的生物膜的形成。2.亚抑菌浓度的莫匹罗星通过上调atlE来促进细菌的自溶和eDNA的产生,从而使表皮葡萄球菌生物膜增厚。
黄永平[4]（2021）在《植物乳杆菌CFS影响表皮葡萄球菌生物膜形成的研究》文中进行了进一步梳理[目的]探讨植物乳杆菌 CICC 6257（Lactobacillus plantarum,Lb.plantarum）无细胞上清液（Cell-free supernatant,CFS）对表面表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis,S.epidermidis）生物膜（Biofilm,BF）形成的影响,为研发新型抗BF药物提供实验依据。[方法]1.结晶紫半定量法确定具有稳定抗S.epidermidis生物膜形成的植物乳杆菌CFS所需培养时间,微量肉汤稀释法和结晶紫半定量法确定CFS最低抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration,MIC）、最低抑制生物膜浓度（Minimal biofilm inhibitory concentration,MBIC）和亚抑菌浓度。2.在S.epidermidis培养中,以加入亚抑菌浓度的植物乳杆菌CFS为实验组,不加植物乳杆菌CFS为对照组,研究植物乳杆菌CFS对S.epidermidis生长曲线、疏水性和自聚性的影响。3.在聚氯乙烯（Polyvinyl Chloride,PVC）表面,以加入培养基为空白组,加入S.epidermidis对照组,加入含不同浓度植物乳杆菌CFS的S.epidermidis为实验组,检测植物乳杆菌CFS对S.epidermidis生物膜形成的影响和对成熟BF的清除率,检测S.epidermidis生物膜内细菌的生长动力,用激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope,CLSM）、扫描电子显微镜（Scanning electron microscope,SEM）观察PVC表面生物膜微观结构。[结果]1.培养4h、8h、12h、24h、30h、48h提取的植物乳杆菌CFS对S.epidermidis生物膜的形成有抑制作用,抑制效果随培养时间延长而增强,在12h达峰值（抑制率99%）且与24h、30h、48h无显着差异（P>0.05）。植物乳杆菌CFS对表皮葡萄球菌MIC、MBIC浓度均为50%（v/v）,亚抑菌浓度确定为60%MIC（v/v）。2.亚抑菌浓度（60%MIC,v/v）的植物乳杆菌CFS对浮游S.epidermidis的生长有抑制作用,使对数生长期延后明显。60%MIC（v/v）植物乳杆菌CFS使S.epidermidis疏水性和自聚性显着降低（P<0.05）。3.亚抑菌浓度（60%MIC,v/v）的植物乳杆菌CFS对PVC表面S.epidermidis生物膜形成的各阶段（6h、12h、24h、30h）均有抑制作用（P<0.05）,其抑制率在BF形成早期（6h）最为显着,达90.33%,抑制作用随培养时间延长而逐渐减弱。4.细菌生长动力实验结果:MIC组与60%MIC组在各时间段相比对照组S.epidermidis生物膜内细菌活力均有显着差异（P<0.05）,60%MIC组在培养12h时细菌活力降低最明显。5.植物乳杆菌CFS对成熟的S.epidermidis生物膜有清除作用,其中MIC、2MIC、60%MIC组清除率分别为63.08%、54.02%、35.15%,MIC组的清除率最大（P<0.05）。6.SEM发现:MIC组PVC表面仅见散在单个菌落,S.epidermidis表面不光滑、菌体皱缩和破裂;60%MIC组S.epidermidis生物膜结构立体性、复杂性、细菌数较对照组差,且见较多未完全分离的“大细胞”,但菌体间仍有丝状黏稠物相连。CLSM发现:相比对照组,MIC组在各培养时间未见BF形成,60%MIC组在各培养时间活菌比例均低,除30h外,60%MIC组BF厚度低、结构稀疏。[结论]1.植物乳杆菌CFS可抑制S.epidermisd菌体分裂,影响细胞膜和细胞壁结构完整性与通透性,进而抑制S.epidermidis浮游菌的生长。2.植物乳杆菌CFS可降低S.epidermidis菌体疏水性、自聚性及生物膜内细菌活力,抑制PVC表面S.epidermidis生物膜的形成。3.植物乳杆菌CFS对成熟的S.epidermidis生物膜有一定清除能力,清除率无明显剂量-效应关系。
孟媛媛,乾莲,郭姝蓉,武有聪,瞿涤[5]（2021）在《SrrAB在葡萄球菌生长代谢及存活中的作用研究进展》文中进行了进一步梳理双组分信号转导系统SrrAB能够感应外界环境中氧浓度的变化,通过磷酸化水平的改变来调控靶基因的转录,进而影响葡萄球菌的多种生物学特性。研究发现SrrAB与葡萄球菌的毒力、生物膜的形成密切相关,而且有氧及厌氧条件下的调控机制不尽相同。然而,SrrAB与葡萄球菌的生长、代谢及其在病原体-宿主互作中的机制尚不清楚。结合课题组研究,本文就近年来SrrAB在葡萄球菌生长、代谢及其在葡萄球菌与宿主固有免疫细胞相互作用中的研究进展进行综述,为控制葡萄球菌引起的感染提供理论依据。
顾蕾[6]（2020）在《基于蛋白质组学与代谢组学技术的表皮葡萄球菌转录因子AbfR的调控网络研究》文中提出表皮葡萄球菌是人体表面分布最广的共生菌,也是临床上引起置入性材料感染的重要致病菌,其致病机制和耐药性产生的原因仍有待进一步研究。ROS造成的氧化损伤是细菌感染过程中需要面对的主要挑战之一,细菌进化出了多种响应氧化应激的调控机制来抵抗这一损伤。AbfR是表皮葡萄球菌中新发现的转录因子,它在表皮葡萄球菌应对氧化应激的过程中起关键作用,也对其聚集能力和生物膜的形成有着显着的影响。然而其调控机制尚不清楚。本课题利用基于TMT标记的定量蛋白质组学和基于LC-Q-TOF MS的非靶向代谢组学方法,探究了 AbfR在表皮葡萄球菌中的调控网络。蛋白质组学数据显示,敲除AbfR后多种参与生物膜形成的蛋白质丰度显着增加,且其变化趋势均指向生物膜形成过程被激活。生物膜半定量实验进一步证实了这一猜想,说明AbfR是表皮葡萄球菌生物膜形成过程中重要的抑制因子。整合蛋白质组学与代谢组学数据发现,AbfR对核酸代谢也有着显着的影响,敲除AbfR后DNA错配修复通路被显着激活。EMSA实验进一步发现AbfR是通过直接与mutS启动子区域结合或去结合来调控错配修复通路的,且这一调控过程受到氧化还原水平的影响。此外,AbfR对表皮葡萄球菌的能量代谢也有着重要意义,敲除AbfR后三竣酸循环、精氨酸代谢、糖酵解等能量相关代谢途径均被抑制。本课题首次将蛋白质组学与代谢组学联用技术运用在了表皮葡萄球菌的研究上,从整体角度探究了转录因子AbfR在表皮葡萄球菌中的调控网络,为进一步了解表皮葡萄球菌的致病和耐药机制提供了支持,也为后续临床耐药菌的分析和抗菌药物的研发提供了理论基础。
向柄全[7]（2020）在《生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌的形成及其持留机制研究》文中研究指明第一部分诱导生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌形成[目的]寻找诱导生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌形成的方法,构建生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌模型,并观察持留菌形态特征及其对混合生物膜结构的影响。[方法]1.培养生物材料表面白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜,分别使用10ug/mL、50ug/mL、100ug/mL的四环素、庆大霉素、利福平、5-氟胞嘧啶（5-FC）、卡泊芬净、氟康唑、CCCP诱导混合生物膜0.5h、lh、3h促进持留菌形成,再使用10ug/mL的环丙沙星及两性霉素B杀灭非持留菌;超声洗脱混合生物膜,平板菌落计数法比较各种方案诱导产生的持留菌数量,寻找诱导持留菌形成的最佳方案;行药敏检测验证持留菌形成。2.以最佳诱导方案诱导生物材料表面真菌-细菌混合生物膜,构建生物材料表面真菌-细菌混合生物膜持留菌体外模型。3.采用生物材料表面真菌-细菌混合生物膜持留菌体外模型,以未经诱导的混合生物膜为空白对照,培养24h后,使用扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope,SEM）观察持留菌的形态特征;以未经处理的混合生物膜为空白对照,未诱导直接灭菌的混合生物膜为阴性对照,使用激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope,CLSM）观察持留菌对混合生物膜结构的影响。[结果]1.根据菌落计数结果,四环素、庆大霉素可诱导表皮葡萄球菌持留,5-FC、卡泊芬净、氟康唑可诱导白色念珠菌持留,以上各药物均为100ug/mL浓度诱导1h效果最佳。100ug/mL利福平诱导表皮葡萄球菌3h也可增加持留菌水平,但效果明显低于上述药物;经各药物诱导后,表皮葡萄球菌、白色念珠菌均无耐药,证明存活微生物均为持留菌。2.使用100ug/mL的四环素、卡泊芬净、5-FC、庆大霉素的诱导生物材料表面真菌-细菌混合生物膜1h,可成功构建生物材料表面真菌-细菌混合生物膜持留菌体外模型;3.SEM观察可见经诱导与未经诱导的混合生物膜表面结构无明显差别,均为以白色念珠菌为骨架,表皮葡萄球菌黏附于表面形成复杂的混合生物膜结构;经诱导的白色念珠菌表面可出现隆起样形态改变,经诱导的表皮葡萄球菌细胞分裂减少,部分体积缩小;活/死菌染色后使用CLSM观察,可见未经诱导的混合生物膜在抗菌药物的作用下被溶解,而经诱导持留菌比例较高的混合生物膜未被溶解;不论生物膜厚薄均可见持留菌,生物膜较薄处持留菌与死菌混杂存在,生物膜较厚处可见大片持留菌。[结论]1.5-FC、卡泊芬净可诱导白色念珠菌持留,四环素、庆大霉素可诱导表皮葡萄球菌持留,诱导效果呈时间-剂量-效应关系,100ug/mL浓度各药物诱导1h时可获得最佳诱导效应;2.使用四环素、庆大霉素、5-FC、卡泊芬净诱导生物材料真菌-细菌混合生物膜可成功构建生物材料表面真菌-细菌混合生物膜持留菌体外模型,解决了既往持留菌数量较少、难以获取的技术难题;3.经诱导的白色念珠菌出现菌体表面隆起样改变,表皮葡萄球菌细胞表现为分裂减少、体积缩小;大量持留菌细胞可以避免混合生物膜被抗菌药物破坏;复杂混合生物膜结构不是持留菌形成的必要条件,但复杂的混合生物膜中可产生更高水平的持留菌细胞。第二部分生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌的持留机制研究[目的]分析生物材料表面表皮葡萄球菌及白色念珠菌混合生物膜中持留菌株与非持留菌株的差异表达基因,寻找可能的持留机制及持留相关基因。[方法]1.以四环素、庆大霉素诱导生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中表皮葡萄球菌持留,5-FC、卡泊芬净诱导白色念珠菌持留,构建生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌模型,以未经诱导的混合生物膜为空白对照;使用Trizol法分别提取各组细菌与真菌的总RNA,使用OD260/280比值及琼脂糖凝胶电泳分别检测总RNA的纯度与完整度。2.以NCBI基因组数据库的转录组序列作为对比参考序列,对总RNA进行RNA-Seq检测,筛选在两种药物诱导形成的持留菌中均与空白对照呈差异表达的共同差异基因,以排除由各药物引起的与持留无关的基因差异表达,并分析其共同差异基因的功能。3.对共同差异基因进行GO富集分析及KEGG Pathway显着性富集分析,寻找共同差异基因主要参与的代谢途径。[结果]1.成功提取细菌与真菌的总RNA,各组样品总RNA的OD260/280比值均大于1.8,白色念珠菌28s、18s rRNA条带及表皮葡萄球菌23s、16s rRNA条带均完整,证明总RNA纯度、完整度较好。2.生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中白色念珠菌持留菌共同差异表达基因684个,表皮葡萄球菌持留菌共同持留菌差异表达基因102个;白色念珠菌持留菌的差异表达基因功能多为增强核糖体功能,减慢细胞分裂,减弱毒力,增强对各种应激的耐受性,且细胞外基质蛋白1（Extracellular matrix 1,ECM1）等黏附相关基因显着上调。表皮葡萄球菌持留菌的DnaK与SceD基因上调,可增加细菌对抗菌药物及不良环境的抵抗能力,但未见其它共同差异表达基因。3.GO富集分析结果显示,白色念珠菌持留菌上调的基因主要富集于分子功能:甲基转移酶活性,转移一个碳基的转移酶活性,核苷三磷酸酶活性,焦磷酸酶活性,ATP耦合酶活性;生物过程:甲基化,rRNA处理,rRNA代谢过程,核糖体形成,ncRNA代谢过程等GO Term;白色念珠菌下调基因及表皮葡萄球菌差异表达基因均无显着富集。KEGG富集分析结果显示:白色念珠菌持留菌上调基因主要富集于:真核生物核糖体的生物发生,RNA聚合酶,嘧啶代谢,嘌呤代谢,ATP结合盒式转运蛋白等通路;白色念珠菌下调基因主要富集于:磷酸戊糖途径,淀粉和蔗糖代谢,谷胱甘肽代谢,磷酸肌醇代谢,RNA降解等通路。表皮葡萄球菌上调基因富集于RNA降解通路,下调基因无明显富集。4.RT-qPCR结果显示,白色念珠菌ECM1基因在各实验组中均较空白组上调;PLC1、PRR2、SAC6、TOR1基因均较空白组下调。表皮葡萄球菌的DnaK基因在各实验组均上调。[结论]1.生物材料表面白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜中持留菌的持留是由多因素、多基因共同引起的以增加微生物对外界不良刺激的耐受性及生存能力为目的的复杂过程,该过程伴有细胞内资源的重新分配,并可能导致微生物的代谢、分裂及致病能力下降。2.白色念珠菌黏附于生物材料表面后,可通过下调PRR2、SAC6、PLC1等基因,形成对多种环境压力耐受但细胞生长抑制、功能低下的持留菌细胞,而ECM1可通过促进白色念珠菌黏附,其可能是白色念珠菌持留的关键基因。3.四环素及庆大霉素可能通过不同基因促使表皮葡萄球菌持留,而表皮葡萄球菌持留菌形成后,可通过上调DnaK基因获得耐受多种环境压力的能力。
杨君[8]（2020）在《利用16SrDNA对慢性鼻窦炎不同中医证型患者的鼻腔菌群结构观察及优势菌属差异性分析》文中提出目的:探索不同中医证型慢性鼻窦炎患者及健康者鼻腔分泌物的菌群结构和不同中医证型的慢性鼻窦炎患者之间鼻腔分泌物主要优势菌属差异性。方法:采集32名不同中医证型（A组:胆腑郁热8例、B组:脾胃湿热8例、C组:肺经风热8例、D组:肺脾气虚8例）的慢性鼻窦炎患者和8例健康者（E组）的窦口鼻道复合体处分泌物,利用16SrDNA分析出鼻腔菌群多样性和结构,并在属水平上对比分析各个组之间占比较多的优势菌属的差异性。结果:1.对各组鼻腔样品菌落进行分析发现,A组物种多样性较其他组低,并且物种的均匀度较其他组低;E组物种多样性较其他组高,并且均匀度较其他组高;B、C、D组物种多样性及均匀度处于处于A组与E组之间。2.A组葡萄球菌属含量明显高于其他组及正常人（P<0.05）;B、C、D组芽孢杆菌属含量明显高于A组及正常人（P<0.05）,葡萄球菌属低于A组及正常人（P<0.05）;B、C、D组之间葡萄球菌属及其他菌属差异性均无统计学意义（P>0.05）。结论:1.不同中医证型慢性鼻窦炎患者及正常人鼻腔菌群种类构成虽然相似,但各物种丰富度存在很大差异。2.不同证型的慢性鼻窦炎患者优势菌属分布存在明显差异,慢性鼻窦炎为胆腑郁热证与葡萄球菌属含量明显增多有关;其他证型与芽孢杆菌属含量明显增多,葡萄球菌属含量相对减少有关;正常人各类菌属含量不存在较大的差别。3.慢性鼻窦炎胆腑郁热证为中医临床常见且发病率最高的证型,可能与其局部鼻腔特殊的以葡萄球菌属为主的菌群结构有一定关系。
陈琪[9]（2020）在《医院空调滤网积尘中耐药菌的生物膜形成能力研究》文中指出目的:本研究旨在通过调查与研究武汉市三家医院不同科室病房空调回风口过滤网积尘中耐药菌的污染种类和水平,探究滤网积尘中主要耐药菌的生物膜形成能力、耐药情况及其两者间的关系,为了解医院病房环境中一段时间的耐药菌污染状况（尤其是耐药葡萄球菌和不动杆菌污染情况）及其生物膜形成能力,从而了解医院病房环境耐药菌的污染严重程度,以及建立检测与评价医院病房环境耐药菌污染的方法提供参考和依据。方法:本研究于2018年11月至2019年9月分别5次采集了武汉市A、B、C医院16个科室病房（每个科室抽取了3间病房）空调回风口过滤网上积尘样本93个,为1.5～3个月积尘/样,通过应用CHROMagar MRSA、Chrom ID ESBLs、Super CARBA等选择培养基从积尘中分离、筛选出相关耐药菌;通过应用VITEK MS全自动快速微生物质谱检测系统对耐药菌进行菌种鉴定;采用96孔聚苯乙烯板对耐药菌中的葡萄球菌和不动杆菌构建生物膜模型,通过结晶紫染色法定量分析生物膜形成能力;同时应用K-B纸片扩散法对其耐药种类和水平进行检测。通过Fisher确切概率法对结果进行分析和比较。结果:（1）A、B、C医院病房93份病房空调回风口过滤网积尘样本共检测、分离到耐药菌121株,内科33株（27.3%）,外科52株（43.0%）,ICU 36株（29.7%）。不同科室耐药菌检出率由大到小依次为:ICU（69.6%）>外科（69.4%）>内科（47.1%）。积尘中检出的耐药菌种属有芽胞杆菌（Bacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、假单胞菌（Pseudomonas）、不动杆菌（Acinetobacter）、肠杆菌（Enterobacter）、埃希菌（Escherichia）等。（2）耐药菌中共分离、鉴定出51株葡萄球菌（20株）和不动杆菌（31株）。葡萄球菌对青霉素、红霉素、氨苄西林、头孢唑林耐药率分别为90.0%、60.0%、55.0%、25.0%,对庆大霉素、左氧氟沙星、克林霉素、利福平、万古霉素耐药率均低于20.0%;不动杆菌对氨曲南、头孢他啶、头孢吡肟、环丙沙星、亚胺培南、美罗培南耐药率分别为90.2%、45.2%、45.2%、45.2%、41.9%、41.9%,对氨苄西林、头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星耐药率均低于30.0%。其中,6株葡萄球菌（30.0%）为多重耐药菌（Multi-drug Resistant Organism,MDRO）,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus,MRSA）有2株;17株不动杆菌（54.8%）为MDRO,多重耐药鲍曼不动杆菌（Multi-drug Resistant Acinetobacter baumannii,MDR-AB）有11株。（3）51株葡萄球菌和不动杆菌中,44株（86.3%）具有生物膜形成能力,其中强阳性8株（17.4%）,阳性18株（39.2%）,弱阳性20株（43.4%）。20株葡萄球菌18株（90.0%）具有生物膜形成能力,其中强阳性2株（11.1%）,阳性8株（44.4%）,弱阳性8株（44.4%）。31株不动杆菌26株（83.9%）具有生物膜形成能力,其中强阳性6株（23.1%）,阳性9株（34.6%）,弱阳性11株（42.3%）。（4）不同生物膜形成能力的葡萄球菌对抗菌药物的耐药率统计学差异无显着性,具有生物膜形成能力的不动杆菌对氨曲南的耐药率（88.5%）高于无生物膜形成能力的不动杆菌（20.0%）,统计学差异有显着性（P<0.05）。结论:（1）三家医院16个不同科室病房空调回风口滤网积尘中共检测、分离出芽胞杆菌、葡萄球菌、假单胞菌和不动杆菌等121株耐药菌,以外科、ICU病房较为多见,由此表明这些科室病房环境中可能存在这些耐药菌不同程度的污染。（2）耐药菌中共分离、鉴定出20株葡萄球菌和31株不动杆菌,其中MRSA、MDR-AB等MDRO有23株（45.1%）。葡萄球菌对青霉素、红霉素、氨苄西林的耐药率超过了50.0%,不动杆菌对氨曲南、头孢他啶、头孢吡肟、环丙沙星、亚胺培南、美罗培南的耐药率都超过40.0%。（3）51株葡萄球菌和不动杆菌中,86.3%具有生物膜形成能力,由此表明相关环境中可能存在的此等耐药菌大多具有生物膜形成能力。90.0%的耐药葡萄球菌具有生物膜形成能力,83.9%的耐药不动杆菌具有生物膜形成能力。（4）不同生物膜形成能力的葡萄球菌对常用抗菌药物（10种）的耐药率统计学差异无显着性,具有生物膜形成能力的不动杆菌对氨曲南的耐药率（88.5%）高于无生物膜形成能力的不动杆菌（20.0%）。
张术涛[10]（2020）在《氟芬那酸防治耐药葡萄球菌感染和骨溶解的研究》文中研究指明背景耐药葡萄球菌感染,以及由于感染引起的破骨细胞激活,是骨科领域面临的重大难题,往往导致植入物表面细菌生物膜的形成和假体松动。近年来,由于大量耐药葡萄球菌的流行和临床上可供选用的全新抗生素的匮乏,导致了人们在治疗各种耐药菌感染时,付出了高昂的代价。氟芬那酸,一种临床上广泛使用的非甾体类抗炎药物,常被类风湿关节炎患者,用于缓解不同部位的疼痛和炎症。在该研究中,我们聚焦于氟芬那酸药物的再利用,探究其预防耐药葡萄球菌感染的疗效,并进一步探索其抑制破骨细胞分化的潜能。方法1.构建兔子胫骨葡萄球菌感染和无菌性炎症模型,观察葡萄球菌浓度,毒力对骨量和骨生物学特性的影响,比较葡萄球菌感染和无菌性炎症对骨量和骨生物力学影响的差别。2.检测氟芬那酸对耐药葡萄球菌的最低有效抑菌浓度和时间-杀菌动力曲线。探究氟芬那酸对植入物表面生物膜形成的影响,并观察细菌超微结构的改变。阐述氟芬那酸杀灭耐药金葡菌的机制。构建小鼠耐药菌感染模型,探讨氟芬那酸在动物体内的抗菌效果。3.检测氟芬那酸对破骨前体细胞增殖、分化和骨吸收的影响。探究氟芬那酸抑制破骨细胞分化的机制。构建小鼠骨质疏松模型,探究氟芬那酸在动物体内预防骨丢失的效果。结果1.在葡萄球菌感染和无菌性炎症模型中,葡萄球菌感染对骨量和骨生物力学特性的影响大于无菌性炎症。并且葡萄球菌的毒力越大,感染葡萄球菌的浓度越高,胫骨的骨量和骨生物力学特性降低的越明显。2.在体外,氟芬那酸能够有效抑制耐药葡萄球菌的生长。即使在亚致死浓度下连续传代,细菌也不易产生耐药突变。同时,抗菌浓度下的氟芬那酸几乎不对动物细胞具有增殖毒性。此外,氟芬那酸抑制细菌耐药基因的表达,增强β内酰胺类抗生素的杀菌活力,抑制细菌壁的合成。对于生物膜相关感染,氟芬那酸还能阻止植入物表面细菌的粘附。在体内,氟芬那酸可以缓解耐药葡萄球菌引起的皮肤和软组织感染,减轻细菌负荷。3.在体外,氟芬那酸抑制破骨前体细胞的分化,降低其骨吸收。同时,不会诱导破骨细胞的凋亡。此外,氟芬那酸抑制破骨相关基因的表达,影响MAPK通路的信号转导并且降低转录因子NFATc1的蛋白水平。在体内,氟芬那酸缓解破骨细胞激活引起的骨密度降低,预防骨质疏松。结论1.葡萄球菌感染与无菌性炎症相比,引起更严重的骨量丢失和骨生物力学特性改变。在治疗葡萄球菌感染时,尤其是高浓度,高致病力细菌,要同时注意预防骨质疏松的发生。2.氟芬那酸有效抑制耐药葡萄球菌的感染,增强β内酰胺类抗生素的杀菌效果,并进一步预防生物膜相关感染,是一种具有潜力的治疗耐药葡萄球感染的药物。3.氟芬那酸抑制破骨前体细胞的分化和骨吸收,降低破骨分化相关基因的表达,并且在体内预防破骨细胞激活引起的骨丢失,是一种有效的治疗骨质疏松的药物。
二、表皮葡萄球菌感染与生物膜形成（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、表皮葡萄球菌感染与生物膜形成（论文提纲范文）
（2）VraSR调控表皮葡萄球菌生物膜形成及药物敏感性的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 课题资助情况 |
| 缩略语中英对照表 |
| 前言 |
| 第一章 vraSR基因敲除对表皮葡萄球菌生物学表型的影响 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验菌株和质粒 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 实验所用引物 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 表皮葡萄球菌SE1457?vraSR突变株的鉴定 |
| 2.2 表皮葡萄球菌SE1457 vraSR基因互补突变株的构建 |
| 2.3 表皮葡萄球菌SE1457及SE1457ΔvraSR的药物敏感性分析 |
| 2.4 vraSR基因敲除对表皮葡萄球菌生长及存活能力的影响 |
| 2.5 vraSR基因敲除对表皮葡萄球菌细胞壁完整性的影响 |
| 2.6 vraSR基因敲除对表皮葡萄球菌耐受力的影响 |
| 2.7 vraSR基因敲除对表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影响 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 表皮葡萄球菌?vraSR突变株及vraSR基因互补突变株的鉴定 |
| 3.2 vraSR基因敲除降低表皮葡萄球菌的药物敏感性 |
| 3.3 vraSR基因敲除对表皮葡萄球菌生长及存活能力的影响 |
| 3.4 vraSR基因敲除降低表皮葡萄球菌细胞壁完整性 |
| 3.5 vraSR基因敲除降低表皮葡萄球菌耐受能力 |
| 3.6 vraSR基因敲除降低表皮葡萄球菌生物膜形成能力 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第二章 VraSR调控表皮葡萄球菌生物膜形成及药物敏感性的分子机制研究 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验菌株和质粒 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 实验所用引物 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 qRT-PCR检测表皮葡萄球菌VraSR感应的环境胁迫因子 |
| 2.2 qRT-PCR检测表皮葡萄球菌vraSR基因不同时间的转录水平 |
| 2.3 表皮葡萄球菌SE1457 及?vraSR突变株的转录组测序 |
| 2.4 qRT-PCR验证SE1457 与?vraSR突变株的差异表达基因 |
| 2.5 Western blot 鉴定His_6-VraR蛋白 |
| 2.6 His_6-VraR蛋白的纯化 |
| 2.7 凝胶阻滞实验分析VraR蛋白与靶基因之间的相互作用关系 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 VraSR感应的环境胁迫因子 |
| 3.2 表皮葡萄球菌SE1457中vraSR基因在不同时间的转录水平 |
| 3.3 表皮葡萄球菌SE1457 及其vraSR突变株的转录组测序结果及分析 |
| 3.4 表皮葡萄球菌SE1457 vraSR突变株中差异表达基因的验证结果 |
| 3.5 His_6-VraR蛋白纯化及鉴定结果 |
| 3.6 凝胶阻滞实验显示VraR蛋白可与疑似靶基因启动子区结合 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 VraSR在葡萄球菌生物膜形成及存活中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及研究成果 |
（3）亚抑菌浓度的莫匹罗星促进表皮葡萄球菌生物膜的形成及其作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一节 亚抑菌浓度的莫匹罗星促进表皮葡萄球菌生物膜的形成 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 结果 |
| 1.莫匹罗星对表皮葡萄球菌的MIC值 |
| 2.表皮葡萄球菌在莫匹罗星作用下的生长曲线 |
| 3.表皮葡萄球菌在莫匹罗星作用下的生物膜半定量实验 |
| 4.刚果红平板观察表皮葡萄球菌在莫匹罗星作用后生物膜的变化 |
| 5.激光共聚焦显微镜观察表皮葡萄球菌在莫匹罗星作用下生物膜的变化 |
| 6.表皮葡萄球菌在亚抑菌浓度莫匹罗星作用下的生物膜初始黏附变化 |
| 7.表皮葡萄球菌在莫匹罗星作用下疏水性和代谢活性的变化 |
| 分析与讨论 |
| 第二节 亚抑菌浓度的莫匹罗星促进表皮葡萄球菌生物膜形成的主要调节机制 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 结果 |
| 1.表皮葡萄球菌在莫匹罗星作用下的自溶和eDNA释放 |
| 2.表皮葡萄球菌在莫匹罗星作用下PIA的释放 |
| 3.转录组数据分析 |
| 4.RT-PCR验证莫匹罗星作用下表皮葡萄球菌生物膜差异表达基因 |
| 5.表皮葡萄球菌1457回补株pRB473-C-atlE质粒的构建 |
| 6.重组质粒pRB473-C-atlE转入受体菌 |
| 7.表皮葡萄球菌1457?atlE敲除株、回补株和野生株转录组水平的鉴定 |
| 8.表皮葡萄球菌1457?atlE敲除株、野生株和回补株的生物膜形成 |
| 9.表皮葡萄球菌1457?atlE敲除株、野生株和回补株的eDNA形成与自溶 |
| 分析与讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 表皮葡萄球菌生物膜的形成过程及重要组成成分 |
| 参考文献 |
（4）植物乳杆菌CFS影响表皮葡萄球菌生物膜形成的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表（以字母顺序排列） |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 材料 |
| 1 实验菌株 |
| 2 生物材料 |
| 3 主要材料和试剂 |
| 4 主要仪器设备 |
| 方法 |
| 1 主要溶液的配制 |
| 2 菌株的活化和植物乳杆菌CFS的制备 |
| 3 植物乳杆菌CFS抗表皮葡萄球菌生物膜形成实验 |
| 3.1 不同培养时间植物乳杆菌CFS抗S.epidermidis生物膜形成的能力 |
| 3.2 植物乳杆菌CFS最低抑菌、抑制生物膜浓度的测定 |
| 3.3 亚抑菌浓度植物乳杆菌CFS对S.epidermidis生长曲线的影响 |
| 3.4 植物乳杆菌CFS对S.epidermidis生物膜形成的影响 |
| 3.5 不同浓度的植物乳杆菌CFS对S.epidermidis生物膜清除率试验 |
| 4 植物乳杆菌CFS对表皮葡萄球菌特性的影响 |
| 4.1 植物乳杆菌CFS对S.epidermidis疏水性的影响 |
| 4.2 植物乳杆菌CFS对S.epidermidis自聚性的影响 |
| 5 植物乳杆菌CFS对生物膜内表皮葡萄球菌生长动力的影响 |
| 6 扫描电镜观察PVC材料表面表皮葡萄球菌生物膜的微观结构 |
| 7 激光共聚焦显微镜观察PVC材料表面表皮葡萄球菌生物膜厚度及结构 |
| 8 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 植物乳杆菌CFS抗表皮葡萄球菌生物膜形成实验 |
| 1.1 不同培养时间植物乳杆菌CFS抗S.epidermidis生物膜形成的能力 |
| 1.2 植物乳杆菌CFS最低抑菌、抑制生物膜浓度的测定 |
| 1.3 亚抑菌浓度植物乳杆菌CFS对S.epidermidis生长曲线的影响 |
| 1.4 植物乳杆菌CFS对S.epidermidis生物膜形成的影响 |
| 1.5 不同浓度的植物乳杆菌CFS对S.epidermidis生物膜清除率 |
| 2 植物乳杆菌CFS对表皮葡萄球菌特性的影响 |
| 2.1 植物乳杆菌CFS对S.epidermidis疏水性的影响 |
| 2.2 植物乳杆菌CFS对S.epidermidis自聚性的影响 |
| 3 植物乳杆菌CFS对生物膜内表皮葡萄球菌生长动力的影响 |
| 4 扫描电镜观察PVC材料表面表皮葡萄球菌生物膜的微观结构 |
| 5 激光共聚焦显微镜观察PVC材料表面表皮葡萄球菌生物膜厚度及结构 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 乳杆菌属在抗细菌生物膜相关感染中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）SrrAB在葡萄球菌生长代谢及存活中的作用研究进展（论文提纲范文）
| 1 TCS-Srr AB在葡萄球菌生长及代谢中的作用 |
| 2 TCS-Srr AB在葡萄球菌抵抗宿主固有免疫中的作用 |
| 2.1 葡萄球菌TCS-Srr AB调节ROS的作用 |
| 2.2 葡萄球菌TCS-Srr AB调节RNS的作用 |
| 3 TCS-Srr AB在葡萄球菌生物膜形成中的作用 |
| 4 TCS-Srr AB在葡萄球菌细胞PCD中的作用 |
| 5 结语与展望 |
（6）基于蛋白质组学与代谢组学技术的表皮葡萄球菌转录因子AbfR的调控网络研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词索引 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 表皮葡萄球菌研究背景 |
| 1.1.1 表皮葡萄球菌简介 |
| 1.1.2 表皮葡萄球菌感染现状 |
| 1.1.3 表皮葡萄球菌感染和耐药的分子机制 |
| 1.2 蛋白质组学简介 |
| 1.2.1 基于质谱的蛋白质组学 |
| 1.2.2 蛋白质组学在微生物领域的应用 |
| 1.3 代谢组学简介 |
| 1.3.1 基于质谱技术的代谢组学 |
| 1.3.2 代谢组学在微生物领域的应用 |
| 1.4 AbfR简介及前期研究成果 |
| 第2章 基于TMT标记的定量蛋白质组学手段揭示了AbfR在表皮葡萄球菌中的蛋白质调控网络 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂及耗材 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 溶剂配制方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 模型构建和细菌培养 |
| 2.3.2 细胞内总蛋白质提取 |
| 2.3.3 色氨酸荧光法测定蛋白质浓度 |
| 2.3.4 SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色 |
| 2.3.5 滤器辅助的样品制备（FASP)酶解（方法参考文献，有部分修改） |
| 2.3.6 TMT标记 |
| 2.3.7 肽段脱盐 |
| 2.3.8 高pH反向液相色谱分级 |
| 2.3.9 LC-MS/MS液质联用方法 |
| 2.3.10 数据库搜索 |
| 2.3.11 生物膜半定量染色 |
| 2.3.12 生物信息学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 实验设计与数据概览 |
| 2.4.2 筛选差异蛋白 |
| 2.4.3 差异蛋白参与的生物学通路分析 |
| 2.4.4 敲除AbfR显着促进表皮葡萄球菌的生物膜形成 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 多组学联用探究AbfR在表皮葡萄球菌中的调控网络 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验试剂及耗材 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 溶液配制方法 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 模型构建与细菌培养 |
| 3.3.2 表皮葡萄球菌胞内总代谢物提取 |
| 3.3.3 代谢物浓度归一化 |
| 3.3.4 LC-Q-TOF MS检测代谢物 |
| 3.3.5 代谢物鉴定 |
| 3.3.6 AbfR蛋白质表达与纯化 |
| 3.3.7 总RNA提取及反转录 |
| 3.3.8 凝胶迁移实验 |
| 3.3.9 生物信息学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 实验设计和数据概览 |
| 3.4.2 差异代谢物筛选及鉴定 |
| 3.4.3 蛋白质组学与代谢组学联合分析 |
| 3.4.4 AbR通过感应氧化应激来调控表皮葡萄球菌的DNA错配修复 |
| 3.4.5 敲除AbfR会抑制表皮葡萄球菌的能量代谢 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录I 在校期间发表的文章 |
（7）生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌的形成及其持留机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 诱导生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌形成 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌的持留机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 持续性感染与持留菌细胞 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）利用16SrDNA对慢性鼻窦炎不同中医证型患者的鼻腔菌群结构观察及优势菌属差异性分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1.慢性鼻窦炎(鼻渊)相关中医理论 |
| 1.1 证型方面的认识及发展源流 |
| 1.2 脏腑经络方面的关系 |
| 1.3 “鼻五度辨证”理论对鼻渊的阐释 |
| 1.4 “胆肺假说”理论的提出及释义 |
| 1.5 “胆肺同治”对鼻渊临床施治用药的意义 |
| 2.慢性鼻窦炎(鼻渊)的相关西医学认识 |
| 2.1 慢性鼻窦炎相关概念、症状及临床分型 |
| 2.2 慢性鼻窦炎相关病因及其机制的理论研究 |
| 第二部分 临床试验研究 |
| 1.病例资料 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 临床诊断标准 |
| 1.3 纳入病例标准 |
| 1.4 排除病例标准 |
| 1.5 终止试验标准 |
| 1.6 剔除及脱落病历标准 |
| 2.试验材料 |
| 2.1 实验所用的主要试剂 |
| 2.2 实验所用主要器械及设备 |
| 3.研究方法 |
| 3.1 试验流程简介 |
| 3.2 资料分组 |
| 3.3 样本采集 |
| 3.4 样本处理与实验过程 |
| 3.5 数据分析方法 |
| 4.试验结果及分析 |
| 4.1 样品取样深度的验证 |
| 4.2 shnnon/simpson、chao1 指数分析 |
| 4.3 稀释曲线分析 |
| 4.4 物种分析 |
| 4.5 属水平上的显着性差异分析 |
| 第三部分 讨论 |
| 1.本研究选题依据 |
| 2.试验方法讨论 |
| 3.试验结果讨论 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 表皮葡萄球菌相关慢性鼻窦炎生物膜形成机制探讨 |
| 参考文献 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果(示例) |
（9）医院空调滤网积尘中耐药菌的生物膜形成能力研究（论文提纲范文）
| 全文缩写词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 1.4 技术路线 |
| 2 结果 |
| 2.1 医院病房空调回风口滤网积尘中耐药菌检测结果 |
| 2.2 滤网积尘中葡萄球菌、不动杆菌生物膜形成能力测定结果 |
| 2.3 滤网积尘中葡萄球菌、不动杆菌耐药表型测定结果 |
| 2.4 滤网积尘中葡萄球菌、不动杆菌生物膜形成能力与耐药性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 医院病房空调回风口过滤网积尘中耐药菌的污染 |
| 3.2 滤网积尘中葡萄球菌和不动杆菌的生物膜形成能力 |
| 3.3 滤网积尘中葡萄球菌和不动杆菌对常用抗菌药物的耐药性 |
| 3.4 滤网积尘中葡萄球菌和不动杆菌耐药性和生物膜形成能力之间的关系 |
| 4 结论 |
| 5 创新点 |
| 6 不足之处 |
| 参考文献 |
| 综述 医院常见致病菌生物膜形成能力的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）氟芬那酸防治耐药葡萄球菌感染和骨溶解的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 绪论 |
| 第一章 葡萄球菌感染和无菌性炎症对骨量和骨生物力学影响的研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 主要仪器和试剂材料 |
| 1.2.2 动物模型的准备和构建 |
| 1.2.3 葡萄球菌感染和无菌性炎症对骨组织影响的检测 |
| 1.2.4 葡萄球菌感染和无菌性炎症对骨量影响的检测 |
| 1.2.5 葡萄球菌感染和无菌性炎症对骨生物力学影响的检测 |
| 1.2.6 数据统计分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 各组胫骨标本的炎症反应和细菌量比较 |
| 1.3.2 各组胫骨标本的骨量比较 |
| 1.3.3 各组胫骨标本的生物力学比较 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 本章结论 |
| 第二章 氟芬那酸防治耐药金葡菌感染及其机制的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 主要仪器和试剂材料 |
| 2.2.2 氟芬那酸的最小抑菌浓度检测 |
| 2.2.3 氟芬那酸的时间-杀菌动力学检测 |
| 2.2.4 细菌对氟芬那酸的耐药突变率检测 |
| 2.2.5 氟芬那酸杀灭葡萄球菌的活死染色检测 |
| 2.2.6 氟芬那酸和β-内酰胺类抗生素的联合杀菌作用检测 |
| 2.2.7 氟芬那酸对动物细胞的毒性检测 |
| 2.2.8 氟芬那酸对细菌超微结构影响的检测 |
| 2.2.9 氟芬那酸抑制内植物表面生物膜形成效果的检测 |
| 2.2.10 氟芬那酸对细菌转录组影响的检测 |
| 2.2.11 氟芬那酸对细菌膜穿透性影响的检测 |
| 2.2.12 氟芬那酸对细菌壁合成影响的检测 |
| 2.2.13 氟芬那酸缓解小鼠皮肤和软组织感染效果的检测 |
| 2.2.14 数据统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 氟芬那酸对葡萄球菌杀菌效果的分析 |
| 2.3.2 氟芬那酸耐药突变率以及与β内酰胺类联合作用的分析 |
| 2.3.3 氟芬那酸对动物细胞毒性的分析 |
| 2.3.4 氟芬那酸对葡萄球菌超微结构影响的分析 |
| 2.3.5 氟芬那酸抑制细菌生物膜形成效果的分析 |
| 2.3.6 氟芬那酸抑制细菌耐药相关基因表达结果的分析 |
| 2.3.7 氟芬那酸抑制细菌壁合成效果的分析 |
| 2.3.8 氟芬那酸治疗小鼠皮肤软组织感染效果的分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章结论 |
| 第三章 氟芬那酸抑制破骨细胞分化及其机制的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 主要仪器和试剂材料 |
| 3.2.2 骨髓单核/巨噬细胞的分离和培养 |
| 3.2.3 氟芬那酸对BMMs细胞增殖活力的检测 |
| 3.2.4 氟芬那酸对BMMs细胞凋亡活性的检测 |
| 3.2.5 抗酒石酸酸性磷酸酶染色检测破骨细胞的分化 |
| 3.2.6 免疫荧光检测破骨细胞F-actin环的完整性 |
| 3.2.7 小牛骨片检测破骨细胞的骨吸收能力 |
| 3.2.8 氟芬那酸对破骨细胞转录组影响的检测 |
| 3.2.9 氟芬那酸对破骨细胞蛋白表达影响的检测 |
| 3.2.10 氟芬那酸防治小鼠骨丢失效果的检测 |
| 3.2.11 数据统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 氟芬那酸对BMMs细胞毒性分析 |
| 3.3.2 氟芬那酸抑制BMMs细胞的破骨分化 |
| 3.3.3 氟芬那酸抑制BMMs细胞的骨吸收 |
| 3.3.4 氟芬那酸在转录组水平上抑制破骨细胞的分化 |
| 3.3.5 氟芬那酸抑制破骨相关基因的表达 |
| 3.3.6 氟芬那酸抑制MAPK通路活化和NFATc1 的表达 |
| 3.3.7 氟芬那酸减轻骨质疏松小鼠的骨丢失 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 今后研究工作展望 |
| 攻读硕士学位期间发表文章和其他成果 |
| 致谢 |
四、表皮葡萄球菌感染与生物膜形成（论文参考文献）
- [1]肺炎克雷伯菌胞外多糖广谱抗生物膜活性研究[D]. 刘姝灵. 南华大学, 2021
- [2]VraSR调控表皮葡萄球菌生物膜形成及药物敏感性的分子机制研究[D]. 孟媛媛. 大理大学, 2021
- [3]亚抑菌浓度的莫匹罗星促进表皮葡萄球菌生物膜的形成及其作用机制[D]. 占晴. 南昌大学, 2021(01)
- [4]植物乳杆菌CFS影响表皮葡萄球菌生物膜形成的研究[D]. 黄永平. 昆明医科大学, 2021
- [5]SrrAB在葡萄球菌生长代谢及存活中的作用研究进展[J]. 孟媛媛,乾莲,郭姝蓉,武有聪,瞿涤. 微生物学通报, 2021(02)
- [6]基于蛋白质组学与代谢组学技术的表皮葡萄球菌转录因子AbfR的调控网络研究[D]. 顾蕾. 华东理工大学, 2020(01)
- [7]生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌的形成及其持留机制研究[D]. 向柄全. 昆明医科大学, 2020
- [8]利用16SrDNA对慢性鼻窦炎不同中医证型患者的鼻腔菌群结构观察及优势菌属差异性分析[D]. 杨君. 成都中医药大学, 2020(02)
- [9]医院空调滤网积尘中耐药菌的生物膜形成能力研究[D]. 陈琪. 华中科技大学, 2020(01)
- [10]氟芬那酸防治耐药葡萄球菌感染和骨溶解的研究[D]. 张术涛. 上海交通大学, 2020