论文摘要
背景与目的:鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci,Cps）是一类专性胞内寄生,多宿主人兽共患病病原体,能感染包括人类在内的多种哺乳动物以及鸟类,引起严重的疾病。有研究报道,质粒缺失株可作为减毒活疫苗抵抗衣原体的感染。Pgp3是衣原体质粒编码的唯一的分泌蛋白,是衣原体的重要毒力因子之一,参与衣原体与宿主细胞相互作用、疾病发生与宿主免疫反应过程。然而以往研究多集中于沙眼衣原体、鼠衣原体,鹦鹉热衣原体质粒蛋白Pgp3鲜有报道。此外,Cps具强致病性及强传染性、疾病常呈隐性感染或持续性感染且存在抗生素耐药,极大威胁人类和畜牧业健康,设计开发相应Cps防治药物与疫苗,对提高全民生活水平和畜牧业健康发展具有重要的科学意义。本研究旨在筛选和鉴定Cps质粒蛋白Pgp3,通过亚定位和同源性分析等确定Cps Pgp3（CPSITp7）。以此为基础,构建基于质粒蛋白CPSITp7多表位多肽疫苗及DNA疫苗,分析其免疫后诱导的特异性体液和细胞免疫应答情况;Cps滴鼻感染小鼠进一步评估其抗感染免疫保护效果,阐明相关新型疫苗的保护效能。本研究将为Cps质粒蛋白Pgp3进一步分析与鉴定及相关疫苗研发提供新思路和实验依据,对Cps防控靶点筛选具有重要指导价值。方法:1.构建Cps质粒基因原核表达载体,IPTG诱导重组质粒蛋白表达、纯化。蛋白超滤、去内毒素后BCA测浓度。重组蛋白免疫BALB/c小鼠,获取小鼠血清进行Western Blot鉴定及多克隆抗体效价测定。He La细胞感染Cps,用制备的蛋白多克隆抗体为一抗,分析目的蛋白在Cps感染的He La细胞中的定位。2.Gen Bank获取Cps 6BC质粒基因序列及蛋白序列以及其它含有质粒的代表性衣原体菌株质粒Pgp3、Pgp4基因序列和蛋白序列,进行相似性与同源性分析。对质粒蛋白CPSITp7与CPSITp8进行抗原表位预测与分析,预测优势抗原表位。3.构建质粒蛋白CPSITp7的串联多表位疫苗SP,分三次免疫BALB/c小鼠,获取小鼠血清进行多克隆抗体效价测定;末次免疫后14 d分离小鼠脾脏,收集脾淋巴细胞进行SP刺激脾细胞增殖实验,对SP刺激脾细胞上清进行细胞因子检测。SP免疫三次后滴鼻感染Cps,感染后第10 d处死感染小鼠,无菌分离肺组织,计数肺组织匀浆上清中包涵体数量及细胞因子表达水平,余下行H&E染色和S-P免疫组化分析。4.构建pc DNA3.1/CPSITp7,转染至He La细胞中并鉴定其在He La细胞中的表达。真核载体pc DNA3.1/CPSITp7分三次免疫BALB/c小鼠,获取小鼠血清进行多克隆抗体效价测定。Cps感染BALB/c小鼠,感染后第10 d处死感染小鼠,无菌分离肺组织,计数肺组织匀浆上清中包涵体数量及细胞因子表达水平;H&E染色和S-P免疫组化分析感染部位病理情况及衣原体载量。无菌分离心、肝、脾、肾和脑组织,部分固定后进行S-P免疫组化分析各组织病理情况及衣原体载量;另一部分行实时定量PCR,检测各组织中Cps载量。结果:1.成功构建了8种重组质粒蛋白原核表达载体并诱导表达纯化出带His标签的重组质粒蛋白CPSITp2、CPSITp6、CPSITp7和CPSITp8;重组质粒蛋白均具有较好的免疫原性与特异性。CPSITp2、CPSITp6、和CPSITp8均定位于包涵体内,CPSITp7大部分定位于包涵体内,未观察到明显的分泌特征。2.Cps质粒基因CPSITp7与CPSITp8及其编码的蛋白与其它衣原体属编码质粒蛋白具有较高的序列相似性及同源性,质粒蛋白CPSITp7是沙眼衣原体Pgp3的同源物,质粒蛋白CPSITp8是沙眼衣原体Pgp4的同源物。质粒蛋白CPSITp7具有丰富的抗原表位;而质粒蛋白CPSITp8没有合适的抗原表位。3.通过联合分析筛选出三个优势抗原表位,成功构建富含T、B表位的多肽疫苗SP,具有较好的免疫原性,能诱导产生较高水平的特异性Ig G和Ig A抗体,表明能诱导产生特异性体液免疫应答;SP能显著刺激小鼠脾细胞增殖,诱导偏于Th1型细胞因子（IL-2、IFN-γ）和促炎因子IL-6的产生,表明能诱导产生细胞免疫应答。4.多表位疫苗SP免疫小鼠在Cps感染后表现出较为轻微的感染症状,能有效清除肺部Cps,肺组织上清IFN-γ水平和IL-6水平显著低于PBS和佐剂对照组;H&E染色和S-P免疫组化结果显示SP免疫小鼠肺组织病理改变明显减轻,衣原体包涵体数量明显少于对照组;表明多表位疫苗SP产生了良好的抗感染免疫保护作用。5.成功构建了pc DNA3.1/CPSITp7。Western Blot鉴定pc DNA3.1/CPSITp7成功转染至He La细胞中并能在细胞内高效表达,在28 k Da处有明显的特异性反应条带。pc DNA3.1/CPSITp7具有较好的免疫原性,能诱导特异性抗体反应。6.pc DNA3.1/CPSITp7免疫小鼠显示较轻的感染症状,相对PBS和空载体对照组,感染部位衣原体载量更低,IFN-γ水平和IL-6水平更低,组织病理改变明显轻于对照组且包涵体数量明显减少。pc DNA3.1/CPSITp7免疫组能改善Cps引起的各组织病变程度,降低各组织Cps的载量,抑制Cps向远端器官扩散,有效加强Cps的清除;特别能有效减轻心、肝组织的Cps载量,但对Cps脑组织传播抑制作用不明显。结论:1.Cps质粒蛋白CPSITp7和CPSITp8均定位于包涵体内且具有较好的免疫原性,能诱导机体产生特异性免疫应答;质粒基因CPSITp7与CPSITp8及其编码的蛋白与其它衣原体属质粒基因及编码蛋白具有较高的序列相似性及同源性。2.质粒蛋白CPSITp7具有丰富的抗原表位,多表位疫苗SP能诱导特异性体液和细胞免疫应答;能有效清除免疫后小鼠肺部Cps,改善肺组织病变程度,降低衣原体载量,表明产生了良好的抗感染免疫保护作用。3.真核载体pc DNA3.1/CPSITp7可在真核细胞内高效表达,具有较好的免疫原性,抗感染免疫实验显示其能改善Cps引起的各组织病变程度,降低各组织内Cps的载量,抑制Cps向远端器官扩散,有效加强Cps的清除。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 王川
导师: 吴移谋
关键词: 鹦鹉热衣原体,质粒蛋白,多表位疫苗,疫苗
来源: 南华大学
年度: 2019
分类: 基础科学,医药卫生科技
专业: 生物学,基础医学
单位: 南华大学
基金: 国家自然科学基金面上项目(81671986),特殊病原体防控湖南省重点实验室(2014-5),湖南省分子靶标协同创新中心(2015-351)
分类号: R392-33
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