SUN1和SUN2在水稻减数分裂中的功能研究

论文摘要

减数分裂是真核生物配子形成过程中的一种重要细胞分裂方式。减数分裂前期I,同源染色体相互识别、配对,并完成联会复合体的组装,保障后期交叉结的正常形成以及同源染色体的正常分离。端粒花束形成是减数分裂中一件非常保守的事件,与染色体运动具有紧密的联系,在减数分裂中发挥着必不可少的作用。近年来,在酵母和哺乳动物中已陆续发现一些参与端粒花束形成的重要因子,并描绘了端粒聚集成簇的分子模型。但在植物中,端粒花束形成的物理进程还未可知。在小鼠和裂殖酵母的端粒聚集模型中,SUN蛋白具有很高的保守性。通过蛋白序列的BLAST比对,我们发现水稻中有两个候选蛋白,分别命名为SUN1和SUN2。采用CRISPR-Cas9的方法,我们在野生型盐稻八号中同时敲除了这两个基因,并获得了sun1 sun2双突变体。观察突变体在减数分裂过程中的染色体行为,发现其偶线期染色体收缩存在缺陷。通过荧光原位杂交实验,我们进一步证明这种缺陷与端粒花束不能正常形成有关。此外在进行荧光免疫检测及统计学分析之后,我们发现sun1sun2双突变体中全长染色体联会、配对以及交叉的形成均存在故障,且HEI10的信号在粗线期及晚粗线期被限制在联会的区域。但是,我们在检测早期重组蛋白时发现,这种故障是不依赖于早期重组事件的。这些结果表明SUN1和SUN2的缺失影响偶线期的端粒花束聚集和染色体收缩成团,并会导致复杂的减数分裂缺陷。通过观察SUN1和SUN2的定位,我们发现SUN1和SUN2共定位于核膜上,且在偶线期染色体收缩成团时,富集在核膜的一侧,呈极性分布。在检测端粒聚集时,发现端粒花束的形成伴随着染色体收缩成团。这表明野生型中SUN1和SUN2的极性迁移可能介导端粒聚集和染色体收缩。此外,我们证实SUN1/SUN2、WIP/SINE1和PSS1可以核膜上建立SUN-KASH-PSS1串联关系。由于拟南芥中AtPSS1和水稻中PSS1都具有减数分裂功能,我们猜测这种结构的形成可能与SUN1和SUN2在减数分裂中的功能密切相关。水稻中SUN1和SUN2具有很高的序列相似性。通过对双突变体分离的单突进行观察,我们发现sun1表现出和野生型一致的减数分裂进程,但sun2却具有比双突变体较弱的减数分裂缺陷。进化树分析的结果显示,水稻的SUN1与拟南芥的AtSUN1、AtSUN2以及小鼠的SUN1关系较近,而水稻中的SUN2与小鼠中的SUN2及玉米中的ZmSUN2关系较近。此外,蛋白免疫印迹分析显示,相同的总蛋白中SUN2具有显著多于SUN1的蛋白量。因此我们认为SUN1和SUN2在进化上的差异可能造成它们表达水平的差异,导致sun1-1和sun2-1单突变体中发挥功能的SUN蛋白量不同,进而产生不同的表型。并且这种表型的差异与拟南芥或小鼠中都是不一样的。综上所述,我们发现SUN1和SUN2在水稻减数分裂过程中参与染色体收缩成团及端粒聚集成束,从而高效的促进同源配对、全长染色体联会和交叉的形成。此外,在共同行使功能的过程中,SUN2可能在具有更重要的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
•   1.1 减数分裂概述
•   1.2 减数分裂的进程
•     1.2.1 减数分裂前期Ⅰ
•     1.2.2 中期Ⅰ
•     1.2.3 后期Ⅰ
•     1.2.4 末期Ⅰ
•     1.2.5 减数分裂Ⅱ（Meiosis Ⅱ）
•   1.3 减数分裂的同源重组机制
•     1.3.1 减数分裂中同源重组的起始
•     1.3.2 减数分裂中的DSB修复
•     1.3.3 减数分裂中CO和 NCO的形成
•   1.4 联会复合体的形成机制
•   1.5 减数分裂的同源配对机制
•     1.5.1 同源重组促进同源配对
•     1.5.2 着丝粒在同源配对中的作用
•     1.5.3 配对中心促进同源配对
•     1.5.4 端粒聚集促进同源配对
•   1.6 端粒花束的形成机制
•     1.6.1 端粒与内层核膜的连接
•     1.6.2 端粒沿内层核膜的运动
•     1.6.3 动力到外层核膜的传递
•   1.7 SUN蛋白的研究进展
•     1.7.1 SUN蛋白的结构特征
•     1.7.2 SUN蛋白的功能研究
•   1.8 选题的依据和目的
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 菌株和载体
•     2.1.3 酶及各种分子生物学试剂
•     2.1.4 培养基
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 水稻SUN蛋白的序列比对及进化树分析
•     2.2.2 SUN1和SUN2的CRISPR-Cas9 基因共敲除系统
•     2.2.3 农杆菌介导的水稻愈伤转化
•     2.2.4 水稻基因组DNA小量提取方法
•     2.2.5 水稻总RNA的提取及基因组DNA的去除
•     2.2.6 RNA反转录成cDNA
•     2.2.7 SUN1和SUN2的全长cDNA序列克隆
•     2.2.8 蛋白原核表达及抗体制备
•     2.2.9 植物蛋白提取
•     2.2.10 Western blot检测
•     2.2.11 酵母双杂交实验
•     2.2.12 筛选酵母cDNA文库
•     2.2.13 双荧光互补（BiFC）实验
•     2.2.14 亚细胞定位实验
•     2.2.15 染色体制片观察
•     2.2.16 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）
•     2.2.17 免疫荧光检测
• 第三章 实验结果
•   3.1 SUN1和SUN2 的基因鉴定
•   3.2 SUN1和SUN2 的蛋白序列分析
•   3.3 SUN1和SUN2 基因的CRISPR-Cas9 双突变体鉴定
•     3.3.1 SUN1和SUN2 基因的CRISPR-Cas9 敲除
•     3.3.2 双突变体sun1-1 sun2-1 的鉴定
•   3.4 SUN1和SUN2 的功能验证
•     3.4.1 SUN1和SUN2 的蛋白检测
•     3.4.2 等位突变体的构建
•   3.5 sun1-1 sun2-1 双突变体中PMCs的减数分裂异常
•   3.6 SUN1和SUN2 的缺失导致端粒花束形成缺陷
•   3.7 sun1-1 sun2-1 双突变体中全长染色体的配对存在缺陷
•   3.8 SUN1和SUN2 的缺失影响联会复合体中央元件的完全组装
•   3.9 sun1-1sun2-1 双突变体中的配对、联会缺陷不依赖于早期重组事件的进行
•   3.10 SUN1和SUN2 基因的突变影响CO的形成
•   3.11 SUN1和SUN2 的缺失限制HEI10 信号的定位
•   3.12 SUN1和SUN2 呈环状共定位在核膜上,但在偶线期会富集在核膜的一侧
•   3.13 SUN2 的缺失导致水稻减数分裂异常,但SUN1 的缺失不会
•   3.14 SUN1或SUN2与WIP或SINE1 互作,WIP或SINE1与PSS1 在核周围互作
• 第四章 讨论
•   4.1 水稻中SUN1和SUN2 蛋白在偶线期的富集现象可能对端粒花束聚集及染色体运动是必需的。
•   4.2 水稻中端粒花束的形成对同源染色体配对和联会不是完全必需的。
•   4.3 SUN1和SUN2 在水稻减数分裂的功能是不完全冗余的。
•   4.4 SUN1/SUN2-WIP/SINE1-PSS1 串联结构的形成可能促进端粒聚集和染色体运动。
• 第五章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 马利军

导师: 马伯军,程祝宽

关键词: 水稻,减数分裂,端粒花束,蛋白,染色体收缩

来源: 浙江师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 浙江师范大学

分类号: Q943

DOI: 10.27464/d.cnki.gzsfu.2019.000188

总页数: 98

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