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Bmfam114a2及P27/Dacapo基因功能初探

2020-12-08阅读(442)

Bmfam114a2及P27/Dacapo基因功能初探

论文摘要

模式动物中存在多种多样的突变体,为人类疾病的研究及发现基因的新功能创造了条件。利用动物疾病模型来研究人类疾病,对于各种疾病的发生、发展规律和防治疗效的机理认识等带来了极大方便。在西南大学家蚕基因库中有一种特殊的体形突变体——短体蚕Sq,其典型特征是,杂合体幼虫躯体显著比野生型短且肥胖,纯合体胚胎期致死。本课题组前期利用分子定位等手段,确定Sq突变的基因组中有一大片段缺失,缺失片段包含了4个基因:Bmfam114a2、Bmdacapo、Bmhipk和Bmkibra。其中Hipk和Kibra属于Hippo信号通路的组成部分,参与调控生物体的体形发育;Dacapo是细胞周期抑制因子;fam114a2基因目前尚无功能研究报道。本研究主要探究了Bmfam114a2及P27/Dacapo基因的功能作用。我们在细胞水平上分析了Bmfam114a2及P27/Dacapo的生物学功能,并且在裸鼠成瘤实验中分析Bmfam114a2对肿瘤发生发展的影响。本论文取得的结果主要有:1.Bmfam114a2的功能研究在本小组之前的研究中已证实Bmfam114a2能抑制家蚕细胞的增殖。通过生物信息学分析表明Bmfam114a2在人中的同源基因fam114a2与癌症及肥胖相关的基因存在关联性。以肾上皮细胞HEK-293T和肾癌细胞OSRC2为研究对象,利用慢病毒包装技术分别在HEK-293T和OSRC2中上调表达Bmfam114a2。利用EDU染色技术分析过表达Bmfam114a2后对HEK-293T细胞的影响,结果表明上调Bmfam114a2表达水平能显著抑制细胞增殖。在OSRC2细胞中,通过细胞划痕及Transwell实验结果表明,Bmfam114a2对肾肿瘤细胞的迁移及侵袭能力有影响。对上调了Bmfam114a2的HEK-293T细胞的细胞周期进行流式检测发现,过表达Bmfam114a2后能让细胞更多的处于G1期。进一步在裸鼠的皮下和尾静脉成瘤实验中,结果与上述实验结果一致。Bmfam114a2在体内实验中也能抑制肿瘤的形成和发展,抑制其转移扩散。2.P27/Dacapo的功能研究P27/Dacapo是一种细胞周期依赖性抑制因子,利用生物信息学等方法分析发现P27/Dacapo与CCND1和CDK6在小鼠、果蝇和人组织器官中的表达模式密切相关。并且在P27/Dacapo突变的肺癌、乳腺癌和胃癌中,CCND1和CDK6也是呈现高表达状态。通过对这三种肿瘤的癌组织与相应的癌旁组织标本检测P27/Dacapo、CCND1和CDK6的表达量变化发现,P27/Dacapo和CDK6存在表达差异。生存曲线分析显示P27/Dacapo和CDK6的表达对病人的预后有紧密关联。将肺癌作为后续研究的主要对象。通过对肺癌病人的癌组织与相应的癌旁组织进行实时定量PCR及免疫组化,结果显示P27/Dacapo和CDK6存在表达差异,CCND1则没有。进一步在肺癌细胞系A549及HTB-182中分别上调和下调表达P27/Dacapo、CCND1和CDK6,发现改变P27/Dacapo和CDK6的表达能影响细胞周期进而影响细胞增殖。我们通过CO-IP、WB和免疫荧光等实验探究发现,P27/Dacapo是通过影响CCND1/CDK6复合物的形成导致细胞周期在G1/S期阻滞,进而抑制细胞周期的进程,并不影响CCND1和CDK6的表达。综上,本研究对Bmfam114a2及P27/Dacapo的功能进行了初步研究,证明Bmfam114a2不仅参与了家蚕体形的发育调控,还对人类肿瘤细胞的增殖转移有显著影响;P27/Dacapo作为细胞周期抑制因子,与人类肿瘤发生发展具有密切关系。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 家蚕作为疾病研究模式的有关进展
  •     1.1.1 家蚕在疾病研究中的作用
  •     1.1.2 短体蚕（Sq）作为疾病模型的研究
  •   1.2 Bmfam114a2 的研究进展
  •     1.2.1 Bmfam114a2 的生物学信息
  •     1.2.2 Bmfam114a2 与细胞周期
  •   1.3 P27/Dacapo的研究进展
  •   1.4 细胞周期与肿瘤
  •     1.4.1 细胞周期调控分子机制
  •     1.4.2 肿瘤形成的分子生物学基础
  •     1.4.3 细胞周期与肿瘤发生的关系
  • 第二章 研究目的和意义
  •   2.1 研究背景、目的和意义
  •   2.2 主要研究内容
  •   2.3 技术路线
  • 第三章 Bmfam114a2 基因功能研究
  •   3.1 实验材料与仪器试剂
  •     3.1.1 实验材料
  •     3.1.2 实验仪器
  •     3.1.3 实验主要试剂及溶液配制
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 哺乳动物细胞培养方法
  •     3.2.2 实时荧光定量PCR
  •     3.2.3 慢病毒包装Bmfam114a2 过表达目的基因质粒构建
  •     3.2.4 慢病毒介导的细胞转染技术
  •     3.2.5 细胞划痕
  •     3.2.6 流式细胞检测
  •     3.2.7 癌细胞转移（Transwell）
  •     3.2.8 裸鼠皮下成瘤
  •     3.2.9 裸鼠静脉成瘤
  •   3.3 研究结果与分析
  •     3.3.1 利用慢病毒包装载体在肿瘤细胞中上调表达Bmfam114a
  •     3.3.2 Bmfam114a2 对肿瘤细胞增殖的影响
  •     3.3.3 检测Bmfam114a2 在小鼠体内对肿瘤形成和发展的影响
  •     3.3.4 Bmfam114a2 对肿瘤细胞迁移侵袭的影响
  •     3.3.5 Bmfam114a2 在小鼠体内对肿瘤细胞迁移侵袭的影响
  •     3.3.6 Bmfam114a2 对细胞周期的影响
  •   3.4 小结与讨论
  • 第四章 P27/Dacapo基因功能研究
  •   4.1 实验材料与仪器试剂
  •     4.1.1 实验材料
  •     4.1.2 实验仪器
  •     4.1.3 实验主要试剂及溶液配制
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 免疫组化
  •     4.2.2 MTT检测
  •     4.2.3 CellTiter-Glo萤光细胞活性检测
  •     4.2.4 蛋白质免疫印记（Western Blot）
  •     4.2.5 免疫荧光
  •   4.3 研究结果与分析
  •     4.3.1 表达模式分析
  •     4.3.2 P27/Dacapo、CDK6及CCND1 与肿瘤的关联
  •     4.3.3 P27、CDK6及CCND1 与肺癌的关联
  •     4.3.4 P27、CDK6及CCND1 影响细胞的增殖
  •     4.3.5 P27、CDK6及CCND1 影响细胞周期
  •     4.3.6 P27 影响CDK6/CCND1 复合物的形成
  •   4.4 小结与讨论
  • 第五章 综合与讨论
  • 参考文献
  • 硕士研究生期间发表论文和参研课题
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 曾杰

    导师: 代方银

    关键词: 肿瘤

    来源: 西南大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 西南大学

    分类号: Q78

    总页数: 72

    文件大小: 3692K

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