发酵乳杆菌L-乳酸脱氢酶的筛选鉴定及其在L-丹参素合成中的应用

论文摘要

L-丹参素（L-DSS）是一种极具生理活性和药用价值的水溶性酚酸类化合物,以抗血栓、抗氧化、抗菌消炎、降血脂、改善微循环等显著药理作用,在预防和治疗心脑血管疾病方面有着广阔的开发前景。此外,它还是合成多种手性物质和生物活性物质的重要中间体。自然界中不存在L-丹参素,从植物丹参中分离得到的是它的对映异构体D-丹参素。对D-和L-丹参素的药理活性和强度进行比较,发现它们具有相同的药理活性,且L-丹参素的药学强度更加突出。近年来,陆续出现了化学合成L-丹参素的报道,但由于其存在污染严重、操作繁琐、成本高、产物光学纯度差、合成效率低等缺点,很大程度上受到了工业化应用的限制。因此,有必要探索出一条绿色安全、操作简单、效率高、成本低廉的合成单一手性L-丹参素的生物途径。研究表明,乳酸脱氢酶能立体选择性还原α-酮酸生成α-羟基羧酸,这为L-丹参素的生物合成提供了参考依据。本研究将L-乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶基因进行共表达,全细胞催化底物3,4-二羟基苯丙酮酸、葡萄糖生产L-丹参素。主要研究成果如下:（1）从实验室保藏的20株乳酸菌中筛选了一株具有较高3,4-二羟基苯丙酮酸还原活性的发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum JN248）。通过对同菌属的Lactobacillus fermentum F-6的全基因组进行分析,从L.fermentum JN248中克隆到了5个L-乳酸脱氢酶基因（lf-l-ldh0845、lf-l-ldh1566、lf-l-ldh1732、lf-l-ldh0611和lf-l-ldh0372,蛋白分子量为3234 kDa）,连接到质粒pETDuet-1上,并导入大肠杆菌中进行诱导表达。对纯化前后的酶液进行SDS-PAGE分析和酶活力检测,发现这5个酶在理论蛋白分子量处都出现明显条带,且LF-L-LDH0845的酶活力最强。（2）对LF-L-LDH0845的酶学性质进行研究,结果发现:LF-L-LDH0845在pH6.0时活性最高且最稳定;最适温度为25℃,在10-25℃时稳定性较好;具有广泛的底物作用范围,最适底物为丙酮酸,其次为苯丙酮酸;对3,4-二羟基苯丙酮酸的Km、Kcat、Kcat/Km分别为11.3709 mM、0.2931 S-1、0.0258 mM-1·S-1。（3）利用来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶与LF-L-LDH0845一起构建了大肠杆菌BL21（DE3）/pETDuet-1-ldh-gdh双酶共表达菌株,以实现辅酶的再生。对诱导条件进行了优化,最佳诱导条件组合为:菌体浓度OD600=0.5,诱导剂浓度0.4 mmol·L-1,诱导温度20℃,诱导时长25 h。（4）对全细胞转化条件进行了优化,最佳转化条件为:转化温度25℃,转化体系pH=6.5,菌体湿重为20 g·L-1,3,4-二羟基苯丙酮酸浓度为70 mmol·L-1。最终,L-丹参素的产量达到15.91 g·L-1。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 丹参及丹参素简介
•   1.2 丹参素的药理活性
•     1.2.1 抗血栓形成
•     1.2.2 抗菌消炎和增强机体免疫力
•     1.2.3 抗氧化及清除自由基
•     1.2.4 钙拮抗
•     1.2.5 保肝和防治肝纤维化
•     1.2.6 抗癌
•     1.2.7 改善微循环
•     1.2.8 保护神经
•   1.3 丹参素的获取方式
•     1.3.1 化学合成
•     1.3.2 生物合成
•   1.4 乳酸脱氢酶
•   1.5 辅酶再生
•   1.6 全细胞转化法
•   1.7 论文立题依据和意义
•   1.8 论文研究内容
• 第二章 材料和方法
•   2.1 菌株和质粒
•   2.2 仪器设备
•   2.3 主要试剂和工具酶
•   2.4 培养基及相关试剂
•   2.5 实验方法
•     2.5.1 菌株的筛选
•     2.5.2 高效液相色谱检测
•     2.5.3 引物设计
•     2.5.4 基因组的提取
•     2.5.5 目的基因的克隆及单基因重组质粒的构建
•     2.5.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
•     2.5.7 重组质粒的转化
•     2.5.8 重组L-乳酸脱氢酶的诱导表达
•     2.5.9 重组L-乳酸脱氢酶的分离纯化
•     2.5.10 重组L-乳酸脱氢酶活性测定
•     2.5.11 重组L-乳酸脱氢酶的酶学性质研究
•     2.5.12 葡萄糖脱氢酶和L-乳酸脱氢酶共表达菌株的构建
•     2.5.13 双酶活性检测
•     2.5.14 诱导条件的优化
•     2.5.15 全细胞转化条件的优化
• 第三章 结果和讨论
•   3.1 菌株的筛选
•   3.2 L-乳酸脱氢酶基因的预测
•   3.3 目的基因的克隆
•   3.4 单基因重组质粒的构建
•   3.5 重组L-乳酸脱氢酶的诱导表达及纯化
•   3.6 L-乳酸脱氢酶基因的序列分析
•     3.6.1 L-乳酸脱氢酶的进化树分析
•     3.6.2 L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列分析
•   3.7 L-LDH0845 的酶学性质分析
•   3.8 辅因子再生工程菌的构建
•   3.9 共表达重组蛋白SDS-PAGE分析
•   3.10 L-LDH和 GDH酶活检测
•   3.11 诱导条件的优化
•   3.12 诱导条件的正交优化实验结果和分析
•   3.13 全细胞催化条件的优化
• 主要结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间的论文成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 卢欢

导师: 蔡宇杰

关键词: 丹参素,乳酸脱氢酶,酶学性质,葡萄糖脱氢酶,全细胞催化

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 江南大学

分类号: TS201.3

总页数: 48

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