赤红球菌SD3的基因组分析及其DnaK蛋白的表达和功能研究

论文摘要

以微生物为主导的生物降解法已是我国目前处理有机废水的主要方法。易培养且繁殖速度快的赤红球菌,作为降解有机溶剂的革兰氏阳性代表菌种红球菌属,在有机溶剂降解中也蕴含着巨大的潜力。在微生物的众多有机溶剂耐受性机制之一就是分子伴侣发挥作用如通过热休克蛋白有效协助某些相关蛋白的正确折叠以消除有机溶剂对细胞的毒害。热休克蛋白70s（heat shock protein70s,Hsp70s）是分子伴侣和折叠催化剂的细胞网络的中心组分,也是最重要的一类热休克蛋白。DnaK是一种重要的Hsp70蛋白质,常被作为研究微生物体内Hsp70s的模型。目前关于赤红球菌的有机溶剂耐受性的相关作用机制并不清楚,对于进一步改善赤红球菌的有机溶剂耐受性的潜在靶标报道较少。本文主要的研究内容和结果如下:1.首先,利用单分子PacBio测序技术,对一株耐有机溶剂赤红球菌SD3全基因组进行测序,获得大小为5.37 Mb,GC含量为70.625%的全基因组。同时,对全基因组进行生物信息学分析,分析结果为赤红球菌的遗传改造和揭示赤红球菌的有机溶剂耐受性机制奠定了基础。2.其次,通过T克隆获得dnaK基因,构建重组质粒pET-28a-dnak。将重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中进行异源表达,并利用镍柱亲和层析法获得大小约为65kDa的重组蛋白,与预期大小一致。通过LC-MS/MS鉴定重组蛋白,确定其为目的蛋白DnaK,得到的重组蛋白可为后期进一步探究DnaK的功能奠定基础。同时,利用圆二色谱分析法对DnaK的二级结构进行分析,发现DnaK蛋白的二级结构主要以β折叠为主,这与后续利用生物信息学在线软件对DnaK进行建模结果一致。3.同时,为探究红球菌SD3内分子伴侣DnaK的生物学功能,进一步探究赤红球菌的有机溶剂耐受性的相关作用机制,利用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,QPCR）研究赤红球菌SD3在有机溶剂胁迫下DnaK表达的变化规律,结果表明,与对照组相比,在甲苯胁迫下DnaK的表达提高到原来的29.87倍,在苯酚胁迫下DnaK的表达提高到原来的3.93倍,这说明DnaK与赤红球菌SD3的有机溶剂耐受性存在紧密关联。此外,使用生物信息学方法在STRING数据库及有机溶剂胁迫下赤红球菌SD3内的差异蛋白中寻找DnaK的互作蛋白,结果显示DnaK会与众多差异蛋白互作,说明DnaK可能通过帮助赤红球菌SD3内有机溶剂耐受性相关蛋白的折叠而发挥作用,这些结果均可为后期进一步分析DnaK与赤红球菌有机溶剂耐受性机制之间的关系提供一些证据。4.最后,对论文进行了总结,并对下一步的研究进行了展望。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
•   1.1 赤红球菌有机溶剂耐受性研究
•     1.1.1 有机溶剂造成的水污染及其处理方法
•     1.1.2 微生物有机溶剂耐受性机制
•     1.1.3 赤红球菌在有机溶剂降解中的应用
•   1.2 Hsp70 的研究概括
•     1.2.1 热休克蛋白的定义与分类
•     1.2.2 Hsp70 的结构与分类
•     1.2.3 Hsp70 与底物的作用
•     1.2.4 Hsp70 基因调控
•     1.2.5 Hsp70 的生物学功能
•   1.3 DnaK的研究现状
•     1.3.1 DnaK与 ATP的相互作用
•     1.3.2 DnaK共分子伴侣系统
•   1.4 研究目的、意义及主要内容
•     1.4.1 研究的目的及意义
•     1.4.2 研究内容及技术路线
• 2 赤红球菌SD3 全基因组测序与分析
•   2.1 实验材料和仪器设备
•     2.1.1 菌株
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 培养基及主要溶液的配制
•     2.1.4 仪器设备
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 菌体的培养与收集
•     2.2.2 基因组DNA提取
•     2.2.3 全基因组测序与组装
•     2.2.4 rRNA/tRNA查找与重复序列预测
•     2.2.5 基因预测及基因注释
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 全基因组DNA的提取、测序和组装
•     2.3.2 rRNA/tRNA查找与重复序列预测
•     2.3.3 基因预测与序列特征分析
•     2.3.4 基因功能注释分析
•   2.4 本章小结
• 3 赤红球菌SD3中dnak基因的克隆、表达与重组蛋白的纯化
•   3.1 实验材料和仪器设备
•     3.1.1 菌株与质粒
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 培养基及主要溶液的配制
•     3.1.4 仪器设备
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 dnak基因的克隆、鉴定与序列分析
•     3.2.2 重组表达载体的构建与鉴定
•     3.2.3 DnaK重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定
•     3.2.4 DnaK重组蛋白的圆二色谱分析
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 dnak基因的克隆与鉴定
•     3.3.2 重组表达载体的构建与鉴定
•     3.3.3 DnaK重组蛋白的表达分析
•     3.3.4 DnaK重组蛋白的纯化及鉴定
•     3.3.5 DnaK重组蛋白的二级结构分析
•   3.4 本章小结
• 4 DnaK的功能分析
•   4.1 实验材料和仪器设备
•     4.1.1 菌株
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 培养基及主要溶液的配制
•     4.1.4 仪器设备
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 利用qPCR研究DnaK在有机溶剂胁迫下的表达变化
•     4.2.2 DnaK互作蛋白的搜寻
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 DnaK在甲苯和苯酚胁迫下的表达变化
•     4.3.2 DnaK互作蛋白的搜寻
•   4.4 本章小结
• 5 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 在读期间公开发表论文（著）及科研情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 樊欣

导师: 彭仁

关键词: 赤红球菌,全基因组测序,机溶剂耐受性,圆二色谱法

来源: 江西师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江西师范大学

基金: 国家自然科学基金项目(编号:31560018)

分类号: Q93

DOI: 10.27178/d.cnki.gjxsu.2019.000341

总页数: 80

文件大小: 3888K

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