环介导等温扩增技术及其在食源性疾病检测中的应用

环介导等温扩增技术及其在食源性疾病检测中的应用

程志杰

黑龙江省绥化市疾病预防控制中心黑龙江绥化152000

【摘要】食源性疾病的主要诱发因素就是食品中的病原微生物,是较为突出的公共卫生问题,因此,对病原微生物进行有效检测是食品安全性的重要保障。本文主要基于环介导等温扩增技术,并对其在食源性疾病中的应用给予探讨。

【关键词】食源性疾病;病原微生物;环介导等温扩增技术;微生物检测

【中图分类号】R344+.3【文献标识码】A【文章编号】1276-7808(2015)-05-375-01

食源性疾病属于公共卫生问题,其主要致病因子就是细菌等病原微生物。在美国的多项研究中,沙门菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希菌等为主要食源性病原微生物。据我国食源性疾病检测局统计结果显示:在最近十年内,由于病原微生物涉及的人数和引发的食源性疾病高达46.4%,其中40.1%为病原体副溶血孤菌,11.3%表现为变形杆菌,9.4%表现为葡萄球菌肠毒素,8.4%表现为蜡样芽孢杆菌,8.1%表现为沙门菌,4%表现为致泄性大肠埃希菌。

一、环介导等温扩增技术(LAMP)

环介导等温扩增技术属于新兴的等温核酸扩增技术,主要用于基因检测,对于现阶段基因检测中存在的弊端能够给予有效处理。LAMP技术的应用,主要利用BstDNA聚合酶,基于不同的靶序列,进而设计出具有特殊性的两种内、外引物,对靶序列上存在的6个独立区域进行特异性识别,进而使循环链置换反应得以启动。在LAMP技术中,在目标DNA上主要集聚着内引物,促进互补链启动的合成,进而产生哑铃状DNA。以自身为模板,此种结构迅速合成DNA,最终得到起始结构茎-环DNA。这样内引物就会交杂在茎-环上,进而在所合成的DNA上,存在一个中间媒介为含有缺口的茎-环DNA,一般情况下,目标序列主要附于茎上。接着利用外引物,促进环状结构在茎末端形成,最后在同一链上,可以形成茎-环DNA混合物,此结构表现为多环的花椰菜形。

二、在食源性病原微生物检测中环介导等温扩增技术的应用分析

1、检测沙门菌

在伤寒和食品中毒中,主要的病原菌之一就是沙门菌,其传播方式为水源、污染食品等。在食物中毒中,比较常见的现象都是由沙门菌引发的。当前所采用的检测方法,在操作方法上均存在易污染性、低灵敏度、费时等缺点,比如传统PCR技术、血清学、生化反应、分离培养等,已经远远不能满足现代流行病学调查和水源及食品的卫生监测要求。近年来,在沙门菌的检测中,部分研究人员已经开始应用LAMP技术,并取得了快速检测。比如,在14种非沙门菌属和猪霍乱沙门菌模板中,将PCR技术与LAMP技术进行对比分析,首先依次10倍稀释猪霍乱沙门菌DNA,最终DNA浓度分布为1fg/u1、10、100和1pg/u1、10、100、1ng/u1。在PCR反应和LAMP反应中分别放入1u1DNA稀释液,对两种方法的灵敏度进行检测,PCR反应在60min内每管可以最低检测到1pgDNA,而LAMP技术在60min内每管可以最低检测到100fgDNA。此外,LAMP的应用可以快速检测出5种生肉中所包含的沙门菌,比如生羊肉、生牛肉、海产品、生鸡肉、生猪肉等,均可以对LAMP技术的特异性进行确认。研究结果显示,对于相同的反应体系,沙门菌具有较好的特异性,检测结果均为阴性的为非沙门菌,这成分说明LAMP的应用可以实现对沙门菌快速有效的检测。

2、检测致泄性大肠埃希菌和志贺菌

肠出血性大肠杆菌可以引发出血性肠炎,传播方式为经口传播。即使一个国家的卫生条件再好,虽然对肠道传染疾病进行了有效控制,但是由于肠出血性大肠杆菌引发的感染问题依然存在且越来越严重。革兰阴性兼性细胞内致病菌变为志贺菌,临床上多引发痢疾,严重威胁人类的身体健康,尤其影响贫困地区。在对致泄性大肠埃希菌和志贺菌进行检测时,临床上常用的方法为PCR法和细菌培养法。比如在某项研究中,在检测致泄性大肠埃希菌和志贺菌时,LAMP技术的应用,不仅具有较高的灵敏性,还能实现有效快速的检测。以上两种病原菌存在相同的靶基因--ipaH用于扩增反应,仅需要两个小时就可以完成整个检测过程,与PCR法相比,不仅用时短,且最小检测限可以达到8cfu,超过PCR法两个数量级。除此之外,许多研究者将LAMP技术应用于副溶血孤菌、阪依肠杆菌、O1587大肠埃希菌等研究中,均具有较高的特异性和灵敏度。

结束语

综上所述,在国内突发公共卫生事件中,LAMP技术的应用是非常有力的检测手段,其优点表现为试剂盒属于国产且检测试剂具有较低的成本、对食源性病原微生物具有较高的灵敏度与特异性,在今后多层次疾病预防控制中LAMP技术的应用奠定了坚实的基础。

参考文献:

[1]徐芊,孙笑红,赵勇,等.副溶血弧菌LAMP检测方法的建立[J].中国生物工程杂志,2014(5).

[2]刘全英,李廷武,高霞.环介导恒温扩增技术快速检测大肠埃希氏菌O157特异基因的建立[J].世界健康文摘,2014(8).

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