猪圆环病毒2型新型疫苗的研制及中和抗体快速检测方法的建立

论文摘要

猪圆环病毒2型（PCV2）感染导致多种猪圆环病毒2型相关疾病（PCVAD）,给全球养猪业造成巨大的经济损失。疫苗接种是预防PCVAD最经济有效的方法。随着免疫压力的加大,PCV2病毒在快速进化,而现有商业化PCV2疫苗的疫苗株均是PCV2a或者PCV2b基因型,其对临床占主导地位的PCV2d毒株的防控效果存有争议。因此研发广谱、高效的PCV2新型疫苗尤为重要。本研究从猪圆环病毒2型流行病学调查、新型疫苗研制以及疫苗效果快速评估方法的建立等方面入手,以期为PCVAD的防控提供必要工具。获得的结果如下:1.于2016-2018年间从全国65家猪场的217份临床样本中,分离获得48株PCV2毒株,测定其基因组序列并进行PCV2遗传变异与进化分析。48株PCV2毒株中PCV2a、PCV2b与PCV2d占比分别为4/48、13/48和31/48。其中,PCV2d亚型在2016年、2017年和2018年占比分别为54.5%、65.2%和71.4%,表明PCV2d亚型在我国逐年增加,并占有优势地位。48株PCV2毒株的基因序列同源性为93.4%-100%。RDP 4.0软件分析分离的48株PCV2毒株,未见重组事件。PCV2d的主要抗原表位(43D/G、115D/G、134N/T、165P/T、169G/R/S、210E/G/D)存在较高的氨基酸残基多样性。仔猪攻毒PCV2d HeB-1株后14、21d血清中病毒滴度均高于PCV2b LN-3株,但差异不显著（p>0.05）。攻毒仔猪的腹股沟淋巴结中PCV2抗原的含量在PCV2d HeB-1株和PCV2b LN-3株之间无明显差异。2.将PCV2 HeB-1株的ORF2基因与分子佐剂—补体C3d-P28进行融合,开发出一种新型PCV2 DNA疫苗（pVOC3）。pVOC3疫苗免疫仔猪后攻毒,可显著减少仔猪血清中PCV2b或PCV2d的病毒拷贝数,产生较高的PCV2特异性抗体,并刺激PCV2特异性干扰素γ分泌细胞的产生,与未加C3d-P28佐剂的试验组（pVO）差异显著（p<0.05）。3.利用马赛克T-细胞疫苗设计软件获得PCV2病毒的马赛克Cap蛋白,其对66条参考PCV2 Cap蛋白具有较好的表位覆盖,与PCV2 HeB-1株、PCV2 LN-3株和PCV2LG株的同源性分别为98.3%、97.0%、91.8%。马赛克Cap蛋白诱骗表位（169-180aa）用Pan DR T辅助细胞表位替换,获得一个改构马赛克Cap蛋白。以PCV2 HeB-1基因组为骨架,将其Cap蛋白基因用优化的改构马赛克Cap蛋白基因进行替换,新设计的PCV2病毒基因组全基因合成后进行真核表达载体构建、PK-15细胞转染及筛选,获得一株新型PCV2毒株,命名为马赛克PCV2 SD株。马赛克PCV2 SD株制成疫苗免疫小鼠,小鼠血清中检测不到诱骗抗体,且与PCV2 HeB-1免疫组相比,血清中和抗体水平提高1.6倍以上。4.将含猪干扰素-γ基因（PoIFN-γ）的真核表达质粒转染PK-15细胞,获得一株可稳定表达PoIFN-γ的PK-15细胞系,命名为PK15-PoIFN-γ细胞系。PK15-PoIFN-γ细胞可显著增强马赛克PCV2 SD株的增殖效率,病毒毒价达1×108.4TCID50/mL以上,且连续传15代后对病毒的增殖无影响。5.改构马赛克Cap蛋白经密码子优化后成功实现大肠杆菌高效表达。改构马赛克Cap蛋白与Gel 01ST佐剂乳化制备成疫苗并免疫仔猪,免疫后14d仔猪血清中即可检测到PCV2特异性抗体,攻毒后仔猪未检测到病毒血症,组织病理变化轻微,腹股沟淋巴结中PCV2病毒含量很低,PCV2特异性IFN-γ-SC的数量显著增加,与攻毒对照组相比差异显著（P<0.05）。同时,改构马赛克Cap蛋白亚单位疫苗对PCV2d HeB-1株、PCV2b LN-3株均能达到保护效果。6.改构马赛克Cap蛋白与佐剂乳化后免疫小鼠制备单克隆抗体,获得15株单抗并完成其中4株单抗（2C5、4G7、5F7、6F8）的鉴定。4株单抗均与改构马赛克Cap蛋白发生特异性反应,与PCV2病毒产生特异性的免疫荧光信号,且与CSFV、PRRSV、PRV、PPV等猪常见病毒无特异性反应。单抗6F8、2C5为PCV2的中和性抗体,其中单抗6F8对PCV2病毒各基因型均有中和活性,而单抗2C5仅对PCV2d亚型毒株有中和活性。7.以PCV2中和单抗6F8为基础,制备了一种PCV2血清中和抗体阻断ELISA试剂盒。以血清中和抗体检测试验结果为标准,PCV2血清中和抗体阻断ELISA试剂盒的检测敏感性为98.9%,特异性为78.9%,与细胞中和试验的符合率为93.3%,批内批间变异系数小于10%,可4℃保存1年以上。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 猪圆环病毒的病原学研究
•     1.1.1 猪圆环病毒的分类
•     1.1.2 猪圆环病毒的理化特征
•     1.1.3 猪圆环病毒的分子生物学特征
•     1.1.4 猪圆环病毒2型的致病机理
•   1.2 猪圆环病毒2型的流行现状
•   1.3 猪圆环病毒2型的检测
•     1.3.1 抗原检测
•     1.3.2 血清学检测
•   1.4 猪圆环病毒2型的疫苗研究进展
•     1.4.1 PCV2灭活疫苗
•     1.4.2 弱毒疫苗
•     1.4.3 基因工程疫苗
•   1.5 本研究的目的与意义
• 第二章 2016-2018年间中国猪圆环病毒2型分子流行病学研究
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 样品采集
•     2.1.2 主要试剂和仪器
•     2.1.3 DNA的提取及PCV2的检测
•     2.1.4 PCV2的遗传特异性分析
•     2.1.5 PCV2的重组分析
•     2.1.6 PCV2d HeB-1株和PCV2b LN-3株的致病性分析
•   2.2 结果
•     2.2.1 PCV2的检测结果
•     2.2.2 PCV2序列的遗传变异和系统发育分析
•     2.2.3 基因重组分析
•     2.2.4 Cap蛋白的氨基酸序列分析
•     2.2.5 PCV2d HeB-1株和PCV2b LN-3株的致病性分析
•   2.3 讨论
• 第三章 猪圆环病毒2型ORF2-C3d-P28.3核酸疫苗的构建及其免疫原性研究
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 实验动物
•     3.1.2 毒株、细胞株
•     3.1.3 主要试剂
•     3.1.4 主要仪器设备
•     3.1.5 pVAX1-ORF2和pVAX1-ORF2-C3d-P28.3质粒的构建
•     3.1.6 重组质粒的转染和鉴定
•     3.1.7重组质粒pVAX1-ORF2和pVAX1-ORF2-C3d-P28.3的免疫仔猪保护实验
•     3.1.8 淋巴结的病变评价以及PCV2含量的测定
•     3.1.9 PCV2特异性IFN-γ-SC的测定
•     3.1.10 统计学分析
•   3.2 结果
•     3.2.1 重组载体的构建及体外瞬时感染
•     3.2.2 免疫仔猪攻毒后日增重以及产生抗体的检测
•     3.2.3 免疫后仔猪血清中病毒含量的测定
•     3.2.4 免疫后PCV2抗原的检测
•     3.2.5 免疫后PCV2特异性IFN-γ分泌细胞的数量测定
•   3.3 讨论
• 第四章 马赛克PCV2 SD株感染性克隆的构建
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 病毒与细胞
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 主要仪器设备
•     4.1.4 试验动物
•     4.1.5 马赛克Cap蛋白氨基酸序列的设计与分析
•     4.1.6 马赛克Cap蛋白诱骗表位的替换
•     4.1.7 马赛克PCV2 SD株的基因组获得
•     4.1.8 马赛克PCV2 SD株的感染性克隆的构建
•     4.1.9 马赛克PCV2 SD株的病毒拯救及鉴定
•     4.1.10 马赛克PCV2 SD株的电镜观察
•     4.1.11 马赛克PCV2 SD株的传代稳定性
•     4.1.12 马赛克PCV2 SD株在小鼠的免疫效力与诱骗抗体水平检测
•     4.1.13 统计学分析
•   4.2 结果
•     4.2.1 马赛克Cap蛋白氨基酸序列的获得
•     4.2.2 马赛克Cap蛋白诱骗表位的替换
•     4.2.3 马赛克PCV2 SD株的基因组获得
•     4.2.4 马赛克PCV2 SD株的感染性克隆的构建
•     4.2.5 马赛克PCV2 SD株的病毒拯救及鉴定
•     4.2.6 马赛克PCV2 SD株的电镜观察
•     4.2.7 马赛克PCV2 SD株的传代稳定性
•     4.2.8 马赛克PCV2 SD株免疫小鼠后的诱骗抗体水平检测
•     4.2.9 马赛克PCV2 SD株在小鼠的免疫效力
•   4.3 讨论
• 第五章 稳定表达猪干扰素γ基因的PK-15细胞系构建及对PCV2增殖的增强作用
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 病毒、细胞与载体
•     5.1.2 主要试剂
•     5.1.3 主要仪器设备
•     5.1.4 猪脾脏总RNA的提取、纯化
•     5.1.5 RT-PCR反转录合成cDNA
•     5.1.6 猪IFN-γ基因的扩增
•     5.1.7 猪IFN-γ真核表达载体的构建
•     5.1.8 测试PK-15细胞的G418耐受性
•     5.1.9 稳定高效表达PoIFN-γ的PK-15细胞系的构建
•     5.1.10 PK15-PoIFN-γ细胞系的生长曲线测定
•     5.1.11 PK15-PoIFN-γ细胞系对PCV2增值的影响
•     5.1.12 PoIFN-γ抗体对PCV2增值的抑制作用
•     5.1.13 统计学分析
•   5.2 结果
•     5.2.1 PoIFN-γ基因的获得
•     5.2.2 真核表达载体PCI-PoIFN-γ的构建与鉴定
•     5.2.3 PK15-PoIFN-γ细胞系构建与鉴定
•     5.2.4 PK15-PoIFN-γ细胞系的生长曲线
•     5.2.5 PK15-PoIFN-γ细胞系对PCV2增值的影响
•     5.2.6 PoIFN-γ抗体对PK15-PoIFN-γ细胞系增殖PCV2的抑制作用
•   5.3 讨论
• 第六章 猪圆环病毒2型改构马赛克Cap蛋白亚单位疫苗的研制
•   6.1 材料与方法
•     6.1.1 病毒与细胞
•     6.1.2 主要试剂
•     6.1.3 主要仪器设备
•     6.1.4 试验动物
•     6.1.5 改构马赛克Cap蛋白氨基酸序列的稀有密码子优化
•     6.1.6 改构马赛克Cap蛋白原核表达载体的构建
•     6.1.7 改构马赛克Cap蛋白原核表达与纯化
•     6.1.8 改构马赛克Cap蛋白的电镜分析
•     6.1.9 改构马赛克Cap蛋白亚单位疫苗的制备
•     6.1.10 改构马赛克Cap蛋白亚单位疫苗对仔猪的免疫效果
•     6.1.11 统计学分析
•   6.2 结果
•     6.2.1 改构马赛克Cap蛋白的基因及载体构建
•     6.2.2 改构马赛克Cap蛋白的表达、纯化与鉴定
•     6.2.3 改构马赛克Cap蛋白的电镜鉴定
•     6.2.4 改构马赛克Cap蛋白亚单位疫苗对仔猪的免疫效果研究
•   6.3 讨论
• 第七章 PCV2病毒Cap蛋白单克隆抗体的制备与筛选
•   7.1 材料与方法
•     7.1.1 试验动物、病毒与细胞
•     7.1.2 主要试验试剂
•     7.1.3 主要仪器设备
•     7.1.4 改构马赛克Cap蛋白的获得
•     7.1.5 动物免疫
•     7.1.6 细胞融合
•     7.1.7 阳性杂交瘤的筛选和鉴定
•     7.1.8 单克隆抗体制备
•     7.1.9 改构马赛克Cap蛋白单克隆抗体的鉴定
•     7.1.10 改构马赛克Cap蛋白单克隆抗体的纯化
•     7.1.11 改构马赛克Cap蛋白单克隆抗体的亲和力测定
•   7.2 结果
•     7.2.1 改构马赛克Cap蛋白的纯化
•     7.2.2 阳性细胞株的筛选
•     7.2.3 改构马赛克Cap蛋白单克隆抗体的鉴定
•     7.2.4 改构马赛克Cap蛋白单克隆抗体的纯化
•     7.2.5 改构马赛克Cap蛋白单克隆抗体的亲和力测定
•   7.3 讨论
• 第八章 猪圆环病毒2型血清中和抗体阻断ELISA检测方法的建立及应用
•   8.1 材料与方法
•     8.1.1 主要试剂
•     8.1.2 主要仪器设备
•     8.1.3 试剂盒各标准物质的制备
•     8.1.4 猪圆环病毒2型血清中和抗体阻断ELISA检测方法的建立
•     8.1.5 猪圆环病毒2型血清中和抗体阻断ELISA试剂盒的评测
•     8.1.6 临床血清样品的检测
•   8.2 结果
•     8.2.1 猪圆环病毒2型标准阴阳性血清的鉴定
•     8.2.2 单抗6F8的HRP标记与验证
•     8.2.3 猪圆环病毒2型血清中和抗体阻断ELISA检测方法的建立
•     8.2.4 猪圆环病毒2型血清中和抗体阻断ELISA试剂盒的评测
•     8.2.5 临床血清样品的检测
•   8.3 讨论
• 第九章 结论
• 创新点
• 参考文献
• 附录 缩略词表
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 侯竹美

导师: 李青旺

关键词: 猪圆环病毒型,新型疫苗,中和抗体,快速检测方法

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

基金: 山东省高等学校优势学科培育计划(兽医生物技术)

分类号: S852.4

总页数: 142

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