鸭坦布苏病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及稳定表达细胞系的建立

论文摘要

鸭坦布苏病毒病（Duck Tembusu virus disease）是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）引起的一种主要侵害水禽的传染病。其中第一个非结构蛋白NS1蛋白是一个有保护性表位且与细胞膜功能有关的蛋白。首先,本研究利用PCR方法从DTMUV AH-F10株cDNA中获得NS1基因,亚克隆至pET-32a中进行原核表达,对表达产物进行鉴定。使用含尿素的Tris缓冲液洗去杂蛋白再梯度复性,纯化重组蛋白,并免疫小鼠制备鼠抗NS1多克隆抗体,琼脂扩散试验测定抗体效价,Western blotting与间接免疫荧光（IFA）试验鉴定该抗体的特异性。再利用PEG融合sp20细胞与小鼠的脾脏细胞,经过克隆亚克隆筛选和ELISA与IFA鉴定,获得了 NS1蛋白的单克隆抗体。利用单克隆抗体对感染DTMUV后不同时间的BHK-21细胞进行IFA试验观察NS1蛋白的表达时间,然后通过脂质体lipofectamine 2000将真核表达重组质粒pcDNA3.1（+）-NS1转染BHK-21细胞,观察NS1蛋白在BHK-21细胞中的亚细胞定位。结果获得了效价达到1:8且Western blotting与IFA试验结果表明具有良好的特异性和反应性鼠抗NS1多克隆抗体,获得了三株IgG1型单克隆抗体,可以用于ELISA、IFA和Western blotting检测,制备的抗体能识别天然NS1蛋白,反应性良好。利用单克隆抗体发现BHK-21细胞感染DTMUV 12h后NS1蛋白开始表达,亚细胞定位显示NS1蛋白主要在细胞质中表达。初步探究了NS1蛋白细胞内表达特征。随后构建重组真核表达载体pLOV-eGFP-NS1并转染293T细胞制备出慢病毒样颗粒,将含慢病毒样颗粒的293 T细胞培养上清感染BHK-21细胞,通过嘌呤霉素进行筛选,构建出能够稳定表达NS1蛋白的细胞系BHK-21-NS1,进行核酸水平的检测,并利用单克隆抗体进行蛋白水平的鉴定。为进一步研究NS1蛋白的作用机制与鸭坦布苏病毒的增殖特性,建立了能够稳定表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的细胞系BHK-21-NS1,并利用单克隆抗体通过Westem blotting检测,结果显示NS1蛋白在BHK-21细胞中能够稳定表达。综上,本研究在利用原核表达系统成功表达了鸭坦布苏病毒NS1蛋白,并制备了多克隆及单克隆抗体,对NS1蛋白真核表达特性做了研究,构建了稳定表达NS1蛋白的分泌表达的细胞系BHK-21-NS1,为NS1蛋白功能的揭示,鸭坦布苏病毒增殖机制的研究奠定了基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 引言
• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 试验材料
•     1.1.2 主要仪器
•   1.2 方法
•     1.2.1 NS1蛋白的原核表达与鉴定
•     1.2.2 NS1蛋白多克隆抗体及单克隆抗体的制备与鉴定
•     1.2.3 NS1蛋白真核表达研究
•     1.2.4 NS1蛋白细胞系的构建及鉴定
• 2 结果
•   2.1 NS1蛋白的原核表达与鉴定
• 50的测定'>    2.1.1 鸭坦布苏病毒TCID₅₀的测定
•     2.1.2 NS1基因的扩增
•     2.1.3 表达载体pET-NS1的双酶切鉴定结果
•     2.1.4 重组质粒pET-NS1的诱导表达
•     2.1.5 重组质粒pET-NS1表达产物的鉴定
•   2.2 NS1蛋白多克隆抗体的制备与鉴定
•     2.2.1 NS1蛋白多克隆抗体的制备
•     2.2.2 NS1蛋白多克隆抗体的鉴定
•   2.3 NS1蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
•     2.3.1 NS1蛋白单克隆抗体的制备
•     2.3.2 NS1蛋白单克隆抗体的鉴定
•   2.4 NS1蛋白真核表达研究
•     2.4.1 NS1蛋白表达时间
•     2.4.2 NS1蛋白亚细胞定位
•   2.5 NS1蛋白细胞系的构建与鉴定
•     2.5.1 NS1蛋白细胞系的构建
•     2.5.2 NS1蛋白细胞系的鉴定
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 周祺

导师: 王桂军

关键词: 鸭坦布苏病毒,蛋白,单克隆抗体,细胞系

来源: 安徽农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 安徽农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.26919/d.cnki.gannu.2019.000642

总页数: 48

文件大小: 2880K

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