MarvelD1对小鼠小肠上皮发育影响及其机制探究

论文摘要

本研究基于课题组前期利用Cre-LoxP系统结合交配方案建立的MarvelD1基因全身敲除型敲除鼠(MarvelD1-/-)模型,初步分析了MarvelD1对小鼠肠道发育的影响及其调控的分子机制,进而构建MarvelD1调控小鼠小肠上皮发育及功能细胞分化的信号网络。课题组前期原位杂交结果证实,在胚胎期E12.5和E15.5天两个时间点,MarvelD1在小鼠内胚层中高水平表达,说明在小鼠消化管发育以及小肠成熟过程中MarvelD1起到重要作用。在对出生当天小鼠小肠取样时发现,和MarvelD1基因野生型(MarvelD1+/+)小鼠相比,MarvelD1基因敲除型(MarvelD1-/-)小鼠出现小肠长度变短的缺陷表型。选择出生后各时间点对野生型和MarvelD1基因敲除型小鼠的体重进行称量发现,在出生早期MarvelD1基因敲除型小鼠体重和MarvelD1基因野生型小鼠体重相比具有显著性差异。本研究中选取出生当天P0,以及出生后1周、2周和6-8周几个不同发育时间点的小肠样品,分别进行了组织形态学和分子水平的检测分析。将MarvelD1基因杂合型(MarvelD1+/-)雄鼠和MarvelD1基因杂合型(MarvelD1+/-)雌鼠合笼后进行繁育,子代依据基因型鉴定结果收集小肠组织样本,分别进行石蜡包埋和液氮冻存处理用于后续实验分析。本研究获得的HE染色和免疫组化结果显示:在出生早期,与MarvelD1+/+小鼠相比,MarvelD1-/-小鼠小肠上皮组织存在明显的组织结构缺陷,上皮细胞分布杂乱无序,基底膜分离,功能型细胞数量减少、分布异常且细胞形态发生了改变。考虑到小肠作为内胚层发育器官具有终身持续更新的特征,并基于不同发育时间点的重要生物学过程,为进一步探究小肠组织缺陷表型产生的分子机制,本实验提取已收集到的出生前胚胎期小鼠的消化管及出生后各时间点的小鼠小肠组织的RNA,通过Real-time PCR测定分析各个时间点下小鼠肠道中Wnt和Hippo信号通路中关键调控分子的表达情况。实验结果表明,随着小鼠周龄的增加,出生后MarvelD1+/+小鼠小肠组织中Wnt5a、Dkk2、Lrp6、APC和Axin等Wnt信号通路中的调节分子以及Hippo信号通路中LATS1、SAV1、Tead2/4和Smad4的表达水平显著性下降,这些调控分子的表达水平随着发育进程的推进而表现出明显下调的趋势;而在MarvelD1-/-小鼠小肠中上述信号通路中的调控分子表达水平并未出现随小鼠周龄不同而发生改变。这一结果提示,MarvelD1通过影响Wnt信号通路和Hippo信号通路中关键调控分子的表达,进而发挥影响小肠发育及功能的生物学作用。综上所述,本研究结果初步确认在MarvelD1基因敲除型小鼠的小肠上皮组织结构表型存在异常改变;在出生后小鼠小肠上皮发育过程中,MARVELD1主要通过影响Wnt信号通路中相关分子的表达和Hippo信号通路中部分调节分子的表达,进而调控了小肠上皮的发育进程,并可能影响小肠功能的完善。整合出生前胚胎期样本检测分析结果,构建了MARVELD1调控小鼠小肠上皮发育及功能细胞分化的分子网络。为深入了解MARVELD1在小鼠内胚层器官发育过程中的作用提供了新思路。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
•   1.1 课题来源
•   1.2 课题研究背景及研究目的和意义
•   1.3 国内外在该方向的研究现状及分析
•     1.3.1 MarvelD1 研究进展
•     1.3.2 胚胎期小鼠小肠发育时间轴及成熟小鼠的小肠上皮细胞
•     1.3.3 Wnt信号通路与小肠发育
•     1.3.4 Hippo信号通路与小肠发育
•   1.4 论文研究内容
•   1.5 技术路线
• 第2章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 小鼠模型
•     2.1.2 引物序列
•     2.1.3 实验试剂与抗体
•     2.1.4 主要实验仪器
•     2.1.5 主要试剂配方
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 小鼠鼠尾基因组DNA提取
•     2.2.2 小鼠基因型鉴定
•     2.2.3 小鼠小肠组织固定及石蜡包埋
•     2.2.4 小鼠小肠组织石蜡切片及苏木素-伊红染色（HE染色）
•     2.2.5 Alcian Blue染色
•     2.2.6 免疫组化染色
•     2.2.7 小鼠小肠组织RNA提取
•     2.2.8 小鼠小肠组织c DNA合成
•     2.2.9 实时定量PCR（Real-time PCR）
•     2.2.10 数据分析及处理
• 第3章 MarvelD1基因敲除对出生后小鼠体重的影响
•   3.1 引言
•   3.2 MarvelD1 敲除鼠的获取与鉴定
•   3.3 MarvelD1 杂合鼠各基因型子代体重分析
•   3.4 MarvelD1 敲除鼠子代体重情况分析
•   3.5 讨论
•   3.6 本章小结
• 第4章 出生后早期MarvelD1 敲除鼠小肠表型及功能细胞差异研究
•   4.1 引言
•   4.2 出生当天MarvelD1 敲除鼠小肠表型以及小肠功能细胞差异
•   4.3 出生后一周MarvelD1 敲除鼠小肠表型以及小肠功能细胞差异
•   4.4 出生两周后MarvelD1 敲除鼠小肠表型以及小肠功能细胞差异
•   4.5 讨论
•   4.6 本章小结
• 第5章 MarvelD1 调控小鼠小肠上皮发育及功能细胞分化分子机制探究
•   5.1 引言
•   5.2 MarvelD1的敲除对小鼠小肠组织中Wnt信号通路的影响
•   5.3 MarvelD1的敲除对小鼠小肠组织中Hippo信号通路的影响
•   5.4 讨论
•   5.5 本章小结
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 曹靓钰

导师: 韩放

关键词: 小肠发育,信号通路

来源: 哈尔滨工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 哈尔滨工业大学

基金: 国家自然科学基金项目《MARVELD1调节组蛋白H4k20me1影响小鼠内胚层细胞迁移及上皮细胞分化的分子机制》展开(项目批准号31571323)

分类号: Q344

DOI: 10.27061/d.cnki.ghgdu.2019.003743

总页数: 83

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