HECT类E3泛素连接酶基因GhUPL7功能研究

论文摘要

蛋白质的降解在细胞的生命活动中发挥着极其重要的作用。泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）是植物进行蛋白降解主要的机制之一,影响植物几乎所有的生长和发育过程,包括光形态建成、细胞循环、胚珠发育、衰老、防御、环境响应和激素信号响应等途径。泛素-蛋白酶体系统主要由3种酶协同作用:泛素激活酶E1（ubiquitin activating enzyme）、泛素结合酶E2（ubiquitin conjugating enzyme）、泛素连接酶E3（ubiquitin protein ligase）。UPL7是一类HECT（Homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus）泛素连接酶,拟南芥中HECT类连接酶有七个成员:UPL1-UPL7,其中,UPL3和UPL5都可以通过泛素化途径来调节植物的生长发育,表明HECT类连接酶参与泛素化途径。课题组前期从陆地棉（Gossypium hirsutum L.）中克隆了GhUPL7基因,为探究HECT类E3泛素连接酶基因GhUPL7的功能,本文通过农杆菌遗传转化方法获得了反义抑制GhUPL7转基因棉花和异源表达GhUPL7拟南芥植株,通过分析转基因材料,本文探究了GhUPL7基因的部分功能。研究结果如下:1.GhUPL7基因表达特性分析基因的表达特性在一定程度上反映了基因的生理功能,分析GhUPL7基因组织器官表达特异性和其启动子,结果显示GhUPL7基因的表达具有组织特异性,在棉花的雄蕊、胚珠中表达水平较高。2.下调GhUPL7基因对棉花成熟纤维品质的影响E3泛素连接酶可以影响作物产量,因此统计了反义抑制GhUPL7转基因棉花产量性状,统计项目包括:衣分、衣指、籽指、每铃种子数和铃重。结果显示下调该基因后,衣分、衣指、籽指含量均显著提高,而每铃种子数含量则显著下降;表明下调GhUPL7基因影响了棉花胚珠和纤维的发育,导致每铃种子数目的减少,最终造成铃重的下降。统计其棉花成熟纤维长度结果显示转基因材料的纤维与野生型相比并无明显差异,表明GhUPL7虽然调控着纤维的起始,但并未影响纤维的最终长度。3.GhUPL7蛋白影响AILP1蛋白的翻译后修饰过程根据前期实验结果,推测GhUPL7蛋白和GhAILP1蛋白能产生泛素化过程,并且GhUPL7基因和AILP1基因在拟南芥中的异源表达表型存在一致性。因此检测了反义抑制GhUPL7转基因棉花与野生型棉花中AILP1的蛋白水平,结果显示:在反义抑制GhUPL7转基因棉花中的AILP1蛋白水平高于野生型棉花;检测异源表达GhUPL7拟南芥植株、野生型和upl7突变体三种拟南芥植株中的AILP1蛋白水平,结果表明AILP1蛋白在upl7突变体中信号最强,野生型中信号次之,异源表达GhUPL7转基因拟南芥植株中信号最弱,说明GhUPL7蛋白影响AILP1蛋白的翻译后修饰过程,推测GhUPL7以GhAILP1蛋白为底物进行了泛素化作用。4.异源表达GhUPL7基因导致拟南芥抽薹提早和第一轮莲座叶侧枝分枝数量的增多将野生型、异源表达GhUPL7拟南芥植株同时种植于营养钵中,结果发现相比野生型,异源表达GhUPL7拟南芥植株出现抽薹提前,第一轮莲座叶侧枝分枝数量显著增多的现象,推测异源表达GhUPL7基因影响拟南芥植株第一轮莲座叶侧枝分枝的发育。5.GhUPL7基因参与植物光形态建成超量表达GhUPL7基因导致棉花出现白化现象,不能正常成苗。已有研究报道,E3泛素连接酶COP1参与植物光形态建成,在黑暗条件下作为光形态建成的负调控因子与HY5相互作用,导致拟南芥下胚轴伸长。因此为探究GhUPL7基因是否参与植物光形态建成,本文分析了GhUPL7基因对拟南芥胚轴的影响。结果显示:与野生型相比,光照条件下异源表达GhUPL7拟南芥植株的下胚轴显著伸长,upl7突变体则变短;黑暗条件下,异源表达GhUPL7同样促进了拟南芥下胚轴的伸长,但其表型无光照条件下明显,突变体植株下胚轴变短;推测GhUPL7基因需在光照条件下才能降解光形态发生的正调控因子。BBX20和BBX25是光形态发生的负调控因子,促进下胚轴的伸长;BBX22是光形态发生的正调控因子,抑制下胚轴的伸长。检测光形态建成途径关键转录因子的表达水平,结果显示:与野生型相比,BBX20、BBX25转录因子在异源表达GhUPL7拟南芥植株中表达量较高,而在突变体中表达受到了抑制;BBX22则出现相反情况,在突变体中的表达量比野生型高,而在异源表达植株中表达量较低,推测GhUPL7是光形态发生的负调控因子,但尚未找到其靶标基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
•   1.1 泛素-蛋白酶体系统
•     1.1.1 泛素
•     1.1.2 泛素化酶与泛素化
•   1.2 泛素连接酶
•     1.2.1 RING类E3连接酶及其研究进展
•     1.2.2 U-box类E3连接酶及其研究进展
•     1.2.3 HECT类E3连接酶及其研究进展
•   1.3 泛素连接酶参与植物光形态建成
•   1.4 棉花GhUPL7的研究基础
•     1.4.1 酵母双杂交结果显示GhUPL7与GhAILP1存在相互作用
•     1.4.2 双分子荧光互补证实GhUPL7与GhAILP1的相互作用
•     1.4.3 GhUPL7基因与AILP1基因在棉花中的表达具有一致性
• 第2章 引言
•   2.1 立题依据
•   2.2 技术路线
• 第3章 材料与方法
•   3.1 材料
•     3.1.1 植物材料
•     3.1.2 菌株与载体
•     3.1.3 主要试剂
•     3.1.4 主要仪器
•     3.1.5 常用试剂配制
•     3.1.6 GUS染液配方
•     3.1.7 基本培养基
•     3.1.8 拟南芥相关培养基
•     3.1.9 棉花遗传转化培养基
•     3.1.10 SDS-PAGE电泳所用缓冲液
•     3.1.11 Western blot检测所用缓冲液
•     3.1.12 植物蛋白提取缓冲液
•   3.2 方法
•     3.2.1 植物基因组RNA提取
•     3.2.2 大肠杆菌质粒提取
•     3.2.3 植物基因组DNA提取
•     3.2.4 cDNA反转录步骤
•     3.2.5 DNA片段的扩增、回收
•     3.2.6 农杆菌感受态的制备
•     3.2.7 农杆菌的转化
•     3.2.8 大肠杆菌的转化（热激法）
•     3.2.9 棉花遗传转化
•     3.2.10 GUS组织化学染色
•     3.2.11 拟南芥遗传转化
•     3.2.12 拟南芥阳性植株的筛选
•     3.2.13 转基因棉花基因表达量分析
•     3.2.14 拟南芥花青素含量的测定
•     3.2.15 植物蛋白提取与定量
•     3.2.16 TAIL-PCR分析拟南芥T-DNA插入位点的侧翼序列
• 第4章 结果与分析
•   4.1 GhUPL7基因表达模式分析
•     4.1.1 GhUPL7基因在陆地棉组织器官中的表达特性分析
•     4.1.2 GhUPL7启动子转基因棉花植株的获得
•     4.1.3 GhUPL7启动子在棉花中的表达模式分析
•     4.1.4 小结
•   4.2 下调GhUPL7转基因棉花株系的筛选及产量性状分析
•     4.2.1 反义抑制GhUPL7转基因植株筛选
•     4.2.2 反义抑制GhUPL7转基因植株产量性状分析
•     4.2.3 反义抑制GhUPL7转基因植株对棉花纤维的影响
•     4.2.4 GhUPL7RNAi干扰转基因棉花植株的获得与筛选
•     4.2.5 小结
•   4.3 异源表达GhUPL7对拟南芥生长发育的影响
•     4.3.1 异源表达GhUPL7转基因拟南芥植株的获得
•     4.3.2 异源表达GhUPL7基因导致拟南芥抽薹提前和第一轮莲座叶侧枝分枝数量增多
•     4.3.3 异源表达GhUPL7促进拟南芥植株的胚轴伸长
•     4.3.4 异源表达GhUPL7对拟南芥光形态建成的影响
•     4.3.5 异源表达GhUPL7对拟南芥中光形态建成关键基因表达水平的影响
•     4.3.6 调控UPL7基因表达对拟南芥中花青素含量的影响
•     4.3.7 异源表达GhUPL7拟南芥T-DNA插入位点的侧翼序列扩增与分析
•     4.3.8 小结
•   4.4 GhUPL7转基因植株中AILP1蛋白水平的检测
•     4.4.1 AILP1蛋白抗体活性检测
•     4.4.2 反义抑制GhUPL7转基因棉花中AILP1蛋白水平的检测
•     4.4.3 异源表达GhUPL7转基因拟南芥以及upl7突变体植株中AILP1同源蛋白水平的检测
•     4.4.4 小结
•   4.5 GhUPL7基因和AILP1基因在拟南芥中表型存在一致性
• 第5章 讨论
•   5.1 泛素连接酶GhUPL7基因参与植物光形态建成
•   5.2 反义抑制GhUPL7转基因棉花纤维与野生型相比无变化
•   5.3 GhUPL7蛋白参与泛素蛋白降解途径
• 第6章 结论
•   6.1 主要结论
•   6.2 主要创新点
• 参考文献
• 附录
•   附录1 主要缩写词
•   附录2 主要引物序列
•   附录3 硕士期间参与课题及发表论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张旭艳

导师: 罗小英,李德谋

关键词: 泛素化,下胚轴,光形态建成

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 西南大学

基金: 国家自然科学基金项目“HECT类E3连接酶GhUPL7调控GhASN-like对棉花产量的影响”(项目编号:31671737),中央高校基本科研业务项目“GhUPL7基因对棉花产量的影响研究”(项目编号:XDJK2014C067),中央高校基本科研业务项目“氮调控棉花根系发育以及棉花对低氮胁迫响应的分子机理”(项目编号:XDJK2017A013),中央高校基本科研业务项目“棉花己糖转运蛋白在胚珠和纤维发育中的功能研究”(项目编号:XDJK2018B028)

分类号: Q943.2

总页数: 72

文件大小: 2225K

下载量: 89