一、棉花抗黄萎病研究取得重大成果（论文文献综述）
张雪[1]（2021）在《海岛棉GbWRKY1基因抗黄萎病的功能研究》文中指出棉花是我国重要的经济作物,其产量和纤维品质都受到黄萎病的严重影响。提高棉花抵御黄萎病能力对于实现高产优质目标具有重要的意义。前期本课题组已经克隆应答黄萎病菌胁迫的转录因子GbWRKY1,在此基础上对其介导棉花抵御黄萎病胁迫的功能和机制进行了初步研究,主要结果如下:1.分别从抗病品种海岛棉Pima90-53和感病品种陆地棉中棉所8号（CRI8）的基因组DNA中克隆了GbWRKY1和GhWRKY1基因编码区全长序列,长度分别为1938 bp和1890 bp,均包含3个内含子和4个外显子。通过基因序列比对分析,发现GhWRKY1在第4外显子区域比GbWRKY1少13个碱基,使得GhWRKY1翻译提前终止,导致其预测编码蛋白比GbWRKY1少15个氨基酸残基;两蛋白均含有两个WRKY保守结构域和两个C2H2型锌指结构,属于WRKY转录因子家族第Ⅰ组成员。2.分别对克隆的抗、感棉花品种的WRKY1启动子序列进行顺式作用元件预测分析,发现两者均含有植物激素调控元件、生物/非生物胁迫响应元件、植物生长发育响应元件和光响应顺式作用元件。分析发现GhWRKY1启动子序列中缺少GbWRKY1所含有的乙烯反应元件。3.外施水杨酸（SA）或茉莉酸甲酯（Me JA）处理棉苗,WRKY1基因在Pima90-53和CRI8中表达模式一致,且其在Pima90-53和CRI8中的表达量差异不显着。在黄萎病菌胁迫或ACC激素处理后,WRKY1基因在Pima90-53和CRI8中表达模式不同,且其在Pima90-53中的表达量显着高于CRI8。由此推测,黄萎病菌胁迫后WRKY1基因在抗、感棉花品种中表达模式不同可能主要和乙烯信号通路有关。4.通过VIGS技术将Pima90-53的内源GbWRKY1基因沉默,与对照植株相比,黄萎病菌胁迫后基因沉默植株表现病情指数显着增大,发病率显着升高,维管束褐化堵塞程度严重。GbWRKY1基因沉默植株中SA信号通路中的NPR1基因和PR1基因的表达量显着高于对照植株,而JA和ET信号通路中的MYC2、AOS、JAZ1、PR4和ACS基因的表达量显着低于对照植株。表明GbWRKY1基因是通过SA、JA和ET信号通路网络参与棉花的抗黄萎病反应。5.转GbWRKY1基因拟南芥株系比野生型的根早期生长更长。黄萎病菌侵染后,转基因拟南芥植株的花序相对缩短程度、鲜重相对降低程度、病情指数和发病率均低于野生型拟南芥。转基因植株中PR4基因的表达量在48 hpi和72 hpi显着高于野生型拟南芥,转基因拟南芥中PR5基因的表达量在48 hpi和72 hpi时显着低于野生型,转基因拟南芥中ACS2基因的表达量在12 hpi和24 hpi时显着高于野生型。另外,黄萎病菌侵染后转基因拟南芥植株POD活性和木质素含量均较野生型明显提高。表明GbWRKY1主要通过参与ET等信号途径调控植株生长发育、影响细胞保护酶活性和抗性蛋白编码基因转录来提高植株抵御黄萎病的能力。
贺浪[2]（2021）在《陆地棉候选感黄萎病基因的克隆及功能研究》文中研究说明棉花是世界上最主要的农作物之一,棉花生产的稳定性,对我国经济发展至关重要。棉花黄萎病（Verticillium wilt）是影响棉花生产的最主要病害,我国的黄萎病菌主要是大丽轮枝菌（Verticillium dahilae Kleb.）。目前,棉花抗黄萎病的机制尚不清楚,且黄萎病菌在土壤中的存活时间长,现有的防治药剂效果并不理想。因此,挖掘棉花与黄萎病菌互作的相关基因,进一步研究相关基因的功能,为培育棉花抗黄萎病提供候选基因。本论文通过对前期转录组测序分析的基础上,筛选了3个下调表达基因Gh BZR1、Gh WRKY74、Gh TGA7进行调控抗黄萎病机理的研究,为培育棉花抗黄萎病品种奠定理论基础。1)利用Real-time PCR技术研究Gh BZR1、Gh WRKY74、Gh TGA7在陆地棉（Gossypium hirsutum L.）中的表达模式。结果表明,黄萎病菌侵染不同抗感材料后,在感病品种中3个基因对比CK的表达呈现上调表达,在抗病品种中三个基因对比CK的表达无显着差异或者呈现下调表达的趋势。通过外源植物激素水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）处理,Gh TGA7、Gh BZR1的表达能被外源SA、JA诱导,Gh WRKY74的表达能被外源SA、JA抑制。2)利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）,发现Gh BZR1、Gh WRKY74、Gh TGA7沉默感病品种86-1植株,发现其对棉花黄萎病菌的抗病性增强。对Gh BZR1、Gh WRKY74、Gh TGA7沉默植株的叶片进行台盼蓝染色,发现基因Gh TGA7、Gh WRKY74、Gh BZR1沉默植株具有减缓细胞坏死的作用。3)利用RACE技术获得Gh BZR1、Gh WRKY74基因全长。Gh BZR1基因全长1515bp,3′UTR350bp,5′UTR 223bp,ORF 942bp,具有BES1＿N超家族结构域,启动子序列中有两个与参与脱落酸的反应的ABRE顺式作用元件;还有一个MYB结合位点参与类黄酮生物合成基因调控的MBSI作用元件。Gh WRKY74基因全长1786bp,其中3′UTR 514bp,5′UTR 291bp,ORF 995bp,Gh WRKY74属于Ⅱd组WRKY成员,该蛋白具有一个WRKY结构域和C2H2模式（CX（4-5）CX（22-23）HXH）的锌指结构。用电子克隆技术获得Gh TGA7基因全长,Gh TGA7全长1786bp,3′UTR 69bp,5′UTR 348bp,ORF 1074bp,该蛋白上有典型的b ZIP蛋白的DNA结合域与DOG1蛋白结构域。另外,通过亚细胞定位技术构建Gh BZR1、Gh WRKY74、Gh TGA7表达载体,在烟草中瞬时表达,结果表明3个基因均定位于细胞核,符合转录因子的特征。4)利用超表达技术,研究转基因Gh BZR1拟南芥对棉花黄萎病的抗性,筛选到的T2代阳性植株进行抗黄萎病鉴定。结果表明,超表达Gh BZR1的转基因拟南芥对黄萎病易感性增强。对防御通路相关基因的表达量分析发现,转Gh BZR1基因拟南芥SA通路相关基因At PR-1、At PR-5、At PAL1的表达量显着上调,JA通路相关基因At PDF1.2、At LOX2的表达受到抑制。因此,Gh BZR1负调控作用参与棉花黄萎病抗性和JA相关通路。
杨芮[3]（2021）在《棉花陆海渐渗系群体的产量品质、抗黄萎病QTL挖掘及qVW-5-1的精细定位》文中研究指明棉花作为一种常见的经济作物,在全球多地区的气候都适宜种植外,纺织技术的发展让民众对于棉花的需求日益增加。衣被民生,利莫赖大,然而棉花上的“癌症”——黄萎病,正严重阻碍着植棉业的发展。因此,培育并推广抗黄萎病的棉花新品种是目前作物育种上的头等大事。以海陆渐渗系MBI9626与中棉所36为亲本,杂交后连续自交两代依次得到F2、F2:3和F2:4群体,测定表型性状;以覆盖棉花26条染色体的2292个SSR（Simple sequence repeat）标记先后对亲本和F2群体进行多态性检测和基因型检测;寻找表型与基因型的对应关系,挖掘与MBI9626纤维产量、品质和黄萎病抗性相关的QTL（Quantitative trait loci）。1.鉴别出16个与纤维产量相关的QTL,包括7个与铃重相关,9个与衣分相关,可解释2.25%-6.14%的表型变异率,其中6个QTL在多年多环境下稳定。12个与纤维品质相关的QTL,包括上半部平均长度3个,断裂比强度4个,马克隆值4个,整齐度1个,可解释2.49%-12.30%的表型变异率,其中2个QTL在多年多环境下稳定。10个与黄萎病抗性相关的QTL,包括发病率6个和病情指数4个,可解释3.32%-10.00%的表型变异率,其中7个QTL在多年多环境下稳定。将q VW-5-1作为目标区段,加密标记,最终锚定在引物A05-130和A05-238之间,物理距离为95 Kb,包含9个基因（GH＿A05G0220-GH＿A05G0228）。2.对大丽轮枝菌V991侵染MBI9626及其双亲海1和中棉所36的一片真叶平展期根部组织（0、7和15天）开展转录组测序,共鉴别到8453个DEGs（Differentially expressed genes）。对最显着的时序表达模式所包含的DEGs进行GO（Gene ontology）富集,主要聚类到与代谢过程、细胞进程、单一生物过程和生物调控,细胞膜、细胞膜部分、细胞和细胞部分,连接和催化活性等亚类,而KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）注释结果显示与植物激素信号转导途径和次生代谢最有关联。3.将转录组测序结果与qVW-5-1精细定位结果相联系,精细定位区间里的9个基因有7个差异表达,综合表达水平、注释信息和国内外生物学研究进展,我们认为GH＿A05G0221、GH＿A05G0223、GH＿A05G0225和GH＿A05G0226可能参与了棉花对黄萎病的防御过程。相关基因功能需要进一步实验证明。
李扬[4]（2020）在《海岛棉GST基因家族遗传进化及关键直系同源基因抗黄萎病功能研究》文中提出黄萎病（Verticillium wilt）是影响棉花产量和品质的最严重病害之一。一般在3～5片真叶期开始显症,现蕾后田间大量发病,可导致整个植株萎蔫或枯死。主要由大丽轮枝菌和黑白轮枝菌引起。通过克隆抗病相关基因,解析棉花黄萎病抗性机制,进行抗病分子改良,进一步选育棉花抗病品种是防治黄萎病最环保、有效的方法。谷胱甘肽硫转移酶基因是生物体中的多基因家族,通过催化谷胱甘肽与胞质内有害物质结合,而后将该复合物排出体外达到解毒细胞的目的。前期研究结果初步证实陆地棉谷胱甘肽硫转移酶基因参与了棉花对黄萎病的抗性反应。但对海岛棉谷胱甘肽硫转移酶基因家族鉴定及关键直系同源基因在海陆棉种中的抗病功能还需进一步研究。本研究通过对海岛棉GST基因家族成员进行鉴定,包括基因数目鉴定、染色体定位、基因结构分析,解析海岛棉GST基因家族遗传进化机制。对海岛棉D亚组09号染色体上的GbGST1 6930基因进行沉默,初步明确该基因的抗黄萎病功能。并对陆地棉中该基因的直系同源基因GhGST1510进行黄萎病抗性研究,从表型和基因表达等方面解析GhGST1510抗黄萎病分子机制,为棉花抗病遗传改良提供基因资源。主要研究结果如下:1.在海岛棉基因组中鉴定出tau类、DHAR类、Ef1bγ类、Lambda类、MAPEG类、Phi类、TCHQD类、Theta类以及Zeta等九类共123个GST基因,他们定位在除D亚组06号染色体之外的25条染色体上,其中tau类基因数目最多。123个基因中,A亚组含61个,D亚组含62个。海岛棉GST基因共形成14个串联重复组,其中13个由tau类组成。Tau类基因大部分有一个内含子,海岛棉中其他几类GST基因含有2到16个内含子不等。通过海岛棉GST基因家族Circle mapping分析发现在海岛棉A亚组02、09和13号染色体及D亚组02、09和13号染色体上对等分布着6个古老的基因簇,其中大部分为tau类GST基因。特别是海岛棉D亚组09染色体上的 tau 类 cluster（GbarD09G016910、GbarD09G01 6920、GbarD09G016930）保留了完整的三个基因,而陆地棉D亚组该直系同源cluster却正在发生基因丢失,只保留了一个基因GhDt09G1520,A亚组直系同源cluster完整保留。该结果为揭示海陆棉种形成的不同分子基础提供了潜在证据。2.利用VIGS沉默海岛棉抗病品种pima90-53中GbGST16930基因,并进行黄萎病抗性鉴定。结果显示沉默效率为70。黄萎病菌胁迫下,沉默植株病指为46,照植株病指为23,沉默植株病情指数显着增加,表明沉默GbGST1 6930基因能够降低海岛棉的黄萎病抗性。3.从抗病陆地棉品种农大601中克隆获得GbGST1 6930的直系同源基因GhGST1510（MK1 79292）。该基因全长651bp,编码216个氨基酸。基因产物含有两个完整的tau类结构域GSTNTau和GSTCTau。4.黄萎病菌胁迫下,较野生型拟南芥,超表达35s:GhGST1510拟南芥纯系植株的病情指数显着降低（从82.8降为32.8）,表明超表达GhGST1510基因能够增强拟南芥的黄萎病抗性。对GhGST1510进行原核表达分析,得到一条大小约24.6 kda的条带,表明GhGST1510基因能够被诱导表达。亚细胞定位结果显示GhGST1510在烟草的上表皮细胞中细胞膜、细胞核、细胞质中均有荧光,表明GhGST1510蛋白定位在细胞膜、细胞核和细胞质中。构建含有GhGST1510的诱饵载体,经酵母双杂交总共筛选出11个可能与GhGST1510互作的候选蛋白,其中含有4个转录因子蛋白,分别为CIPK3、ABCI19、GATA9以及MYB330。预示着GhGST1510可能参与包括ABA路径以及SA合成等多个抗病路径。综合以上结果,本研究明确了海岛棉中包含123个GST基因,位于D亚组09染色体上的一个tau类cluster经历了与陆地棉不同的进化机制。对其中GbGST16930基因进行沉默,沉默植株降低了黄萎病抗性。对GbGST1 6930基因在陆地棉中的直系同源基因GhGST1510功能研究表明,超表达拟南芥植株对黄萎病抗性增强。GhGST1510在细胞膜、细胞质和细胞核中均有分布。酵母双杂交筛选到1 1个可能与GhGST1510互作的蛋白,涉及ABA路径以及SA合成等多个抗病路径。
熊显鹏[5]（2020）在《Gh4CL30和GhWRKY70D13在棉花抗黄萎病中的功能研究》文中认为目的:棉花（Gossypium hirsutum L.）是世界上重要的经济作物和天然纤维的主要来源,在国民经济中占有重要地位。棉花在生长过程中经常会受到各种生物和非生物的胁迫导致棉花减产,如冷害、干旱和病虫害等。由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起的棉花黄萎病（Cotton Verticillium Wilt）是影响世界棉花生产最为严重的病害,被称为棉花的“癌症”。提高棉花品种对黄萎病菌抗性是防治黄萎病最经济和最有效的方法。由于陆地棉缺乏黄萎病抗源,常规育种手段很难解决其抗病难题。因此,开展棉花抗黄萎病分子机制研究,对利用基因工程手段提高陆地棉对黄萎病抗性具有重要意义。方法:（1）本研究利用转录组测序（RNA-seq）技术,对陆地棉中抗黄萎病品种石大陆抗-1（SD）和感黄萎病品种军棉1号（JM）之间差异表达基因进行挖掘,并对其中受黄萎病菌诱导表达的基因所涉及的相关通路进行了注释,利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）筛选抗病候选基因。（2）分析了SD和JM接种黄萎病菌后不同时间点的差异表达基因,利用Blast2GO和KOBAS 2.0软件分别对黄萎病菌诱导的差异表达基因进行了KEGG和GO富集分析。（3）利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、病毒诱导基因沉默（VIGS）和其它生理生化方法,揭示Gh4CL30调控棉花抗黄萎病的机制。（4）通过VIGS、RNA干扰（RNAi）、RNA-seq和其它生理生化方法,阐明GhWRKY70D13在棉花抗黄萎病反应中的作用。结果与结论:（1）在未接种黄萎病菌的陆地棉抗感品种SD和JM之间鉴定了6831个差异表达基因,其中2866个基因在SD中高表达,3965个基因在JM中高表达。在这些差异基因中,有3685和3239个基因分别在SD和JM中受黄萎病菌诱导差异表达,表明SD和JM之间大部分的差异表达基因都参与棉花对黄萎病菌侵染的应答。根据接种黄萎病菌后不同时间点的表达谱,对这6831个差异基因进行WGCNA分析,共鉴定了23个核心抗病候选基因。（2）SD和JM在接种黄萎病菌不同时间点（12、24和48 h）与未接菌（0 h）相比,分别检测到2010和1275个差异表达基因。GO功能富集显示,SD和JM中的差异表达基因都主要参与单一生物代谢过程和氧化还原过程。KEGG功能富集分析结果表明,苯丙氨酸代谢、单萜生物合成、倍半萜和三萜生物合成、二萜生物合成和植物昼夜节律的基因都在SD和JM中富集,而苯丙烷生物合成途径和植物激素信号转导只在SD中富集。研究发现大量木质素合成相关基因在SD和/或JM中被黄萎病菌诱导上调表达。此外,13个植物激素信号转导相关基因在SD和/或JM中被诱导,这些基因涉及水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ET）和油菜素类酯信号通路。（3）qRT-PCR分析表明Gh4CL30在棉花茎中优势表达,并在抗感材料根和茎中受黄萎病菌诱导上调表达,表明Gh4CL30可能参与棉花对黄萎病的抗性。利用VIGS技术抑制Gh4CL30在棉花中的表达,棉花植株对黄萎病菌的抗性显着提高。抑制Gh4CL30表达降低了黄酮、总木质素和S单体含量,却增加了G单体含量和G/S的比值。与对照植株相比,Gh4CL30沉默植株中SA和JA含量及信号通路相关基因的表达均被显着抑制,这表明Gh4CL30沉默植株对黄萎病抗性的提高可能不依赖于SA和JA信号通路。与对照植株相比,Gh4CL30沉默植株中咖啡酸和阿魏酸含量增加,进一步研究发现,外源添加咖啡酸和阿魏酸可以显着抑制黄萎病菌菌丝生长。以上结果表明,抑制Gh4CL30表达可以增强棉花对黄萎病菌的抗性,这可能与木质素组份改变以及咖啡酸和阿魏酸的积累有关。（4）在亚洲棉、雷蒙德氏棉和陆地棉中分别鉴定得到5、5和10个WRKY70基因。进化分析结果显示,棉花WRKY70转录因子是AtWRKY70的同源蛋白。在每个GhWRKY70基因启动子中至少都包含了一种激素响应顺式元件。GhWRKY70D13在根和茎中的表达高于其它组织,同时该基因受黄萎病菌诱导上调表达。利用VIGS和RNAi的方法抑制GhWRKY70D13的表达提高了棉花对黄萎病的抗性。比较转录组学和qRT-PCR分析发现抑制GhWRKY70D13的表达导致ET和JA合成和响应基因的表达被激活。此外,GhWRKY70D13-RNAi植株中1-氨基环丙烷-1-羧酸、JA和茉莉酸异亮氨酸的含量均显着高于野生型植株。以上结果表明,抑制GhWRKY70D13能激活ET和JA信号通路,从而提高GhWRKY70D13抑制表达植株对黄萎病菌的抗性。
张向月[6]（2020）在《GhSDH1-1正向调控棉花对黄萎病抗性的机制研究》文中研究说明棉花黄萎病（Verticillium wilt）是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起的危害性最大的棉花病害之一,而棉花对黄萎病的复杂抗性机制尚不清楚。鉴定内源抗性基因是研究、控制这种病害的重要手段。先前的研究表明,琥珀酸脱氢酶（SDH）作为线粒体的标志酶,可将琥珀酸催化为富马酸,并且参与了活性氧（ROS）诱导的应激信号传递途径,该途径可能由水杨酸（SA）触发。对接种大丽轮枝菌的陆地棉（Gossypium hirsutum）中植棉2号进行代谢组学和基因差异表达分析,获得了差异表达显着的SDH1亚基的GhSDH1-1基因。运用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术和过表达等方法,在棉花和拟南芥上对GhSDH1-1基因进行功能验证,并进一步用生物学、细胞学等方法分析其防御反应机制以及相关的信号通路。取得的结果如下:将拟南芥的SDH蛋白序列与陆地棉的SDH蛋白序列进行比对,鉴定出19个SDH基因。qRT-PCR检测SDH基因在棉花根中的表达模式,结果表明GhSDH1-1的表达水平在受到大丽轮枝菌侵染后显着升高,并在感染后6和12小时达到峰值,为对照组的2.27和2.18倍。且SA也可以诱导Gh SDH1-1的表达上调。说明Gh SDH1-1可能在棉花对大丽轮枝菌的防御反应中起重要作用。利用VIGS技术,在棉花中成功沉默该基因。接种试验表明,沉默植株与对照相比更容易受到大丽轮枝菌的影响。沉默植株叶片出现棉花黄萎病的典型症状,变黄、萎蔫、脱落甚至枯死;而对照植株变黄、萎蔫的叶片明显较少,没有严重的脱落和枯死植株。在接种后20d和25d,TRV::GhSDH1-1植株的病情指数为27.2和40.4,显着高于对照的18.7和23.0。在拟南芥中过表达该基因后,接菌试验表明,转基因株系对大丽轮枝菌的抗性显着增强。表明Gh SDH1-1正调控棉花对黄萎病的抗性。对沉默的棉花植株进行分析,发现TRV::GhSDH1-1植株中抗性相关基因POD、PPO、PAL、HIN、JAZ、NPR1、PR1、PR3的表达量显着下降,叶片中死细胞数较多、活性氧爆发减少、茎部维管束褐变更严重、病菌更多,H2O2和NO的含量显着降低,SA和富马酸的含量也显着减少。表明TRV::GhSDH1-1植株对黄萎病的防御反应明显减弱。在烟草叶片中对GhSDH1-1进行亚细胞定位试验,构建融合表达载体,通过与线粒体标记基因Mt-rk进行共定位,证实该基因定位于线粒体。用琥珀酸和富马酸处理不同品种的棉花后,调查其抗病性变化。发现用琥珀酸处理后,中植棉2号和冀棉11的抗病性增强,豫棉21无显着变化;富马酸处理后,中植棉2号和冀棉11的抗病性降低,豫棉21无显着变化,推测棉花的抗病性可能与SDH酶活性有关。
赵晶[7]（2019）在《陆地棉GhLAC家族鉴定及候选基因抗黄萎病功能研究》文中认为棉花是世界上重要的经济作物,黄萎病严重危害棉花产量和纤维品质,寻找抗黄萎病基因,明确基因功能,深入解析棉花抗黄萎病的分子机制是棉花抗病育种中亟需解决的重要科学问题。高质量版本的基因组是提升基因家族分析准确性的必要条件。本研究以目前最新的陆地棉TM-1高质量版本基因组为参考,通过生物信息学分析鉴定了陆地棉基因组中的Laccase（LAC）基因家族,并对其进行了理化性质、基因结构、染色体定位以及在黄萎病胁迫下的表达模式分析。结合抗病转录组数据和全长cDNA文库筛选以及功能尚未报道的前提,挑选出4个与拟南芥直系同源的新基因,分别命名为GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12。为明确候选基因抗黄萎病功能及分子机制,本研究进一步从基因表达、VIGS基因功能方面研究了四个候选基因的功能。主要研究结果如下:1.陆地棉TM-1基因组鉴定到83个LAC家族成员,分布在24条染色体上,所有LAC蛋白均定位在胞外,且具有相同/相似的保守基序。系统发育树分析显示LAC基因家族成员可分为7个亚组。生物信息学分析GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12分别编码558、564、563、510个氨基酸残基蛋白,GhLAC4,GhLAC7和GhLAC11分别含有一个信号肽,GhLAC12没有信号肽,GhLAC11具有一个跨膜域,其他三个基因无跨膜域。亚细胞定位结果显示,四个漆酶基因编码蛋白都定位在细胞外。2.基于黄萎病胁迫下抗病陆地棉农大601的转录组数据,将LAC基因家族各成员的表达分为3种模式,第1类基因呈现出病原菌诱导后表达上调,包括GhLAC79、GhLAC80、GhLAC43等24个成员;第2类基因受病原菌胁迫后呈现不同程度下调表达,包括GhLAC07、GhLAC40、GhLAC45、GhLAC72等56个成员,接菌后这些基因的表达明显受到抑制,暗示这些基因在棉花抗黄萎病反应中起负调控作用;第3类基因不响应黄萎病菌处理,推测其不参与棉花抗黄萎病过程,包括GhLAC11、GhLAC27和GhLAC49。3.进一步利用实时荧光定量PCR鉴定了4个漆酶基因受黄萎病菌诱导后的表达,发现GhLAC4,GhLAC11和GhLAC12受黄萎病菌诱导表达上调,与转录组表达趋势一致,GhLAC7受黄萎病菌抑制表达。组织特异表达结果显示4个基因在根、茎、叶中均表达;GhLAC4在茎中表达量最高,在根中表达量次之;GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12在根中表达量最高,茎中次之,叶中表达量均最低。4.启动子元件分析表明GhLAC4基因含有响应茉莉酸甲酯（JA）和水杨酸（SA）的顺式作用元件,GhLAC11含有响应SA的顺式作用元件;棉苗叶面喷施SA或JA,基因表达结果表明GhLAC4响应SA和JA信号;GhLAC11仅响应SA信号诱导。5.从抗病农大601中克隆GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12目的片段,长度为340 bp左右,构建VIGS载体。接黄萎病菌25d后,四个基因的沉默棉株病指低于对照,抗病性增强,沉默棉株的H2O2,SOD和NO含量高于对照;沉默棉株的POD活力低于对照。6.接菌25d的沉默棉株和对照棉株的木质素原位染色与测定结果显示,沉默棉株木质素染色均变浅,说明漆酶基因沉默后木质素积累降低;溴乙酰法进一步测定木质素含量表明,沉默棉株GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12木质素百分含量分别为15.34%、7.58%、14.78%、23.22%,对照棉株木质素百分含量为33.31%。7.利用qRT-PCR分析沉默植株苯丙烷途径木质素合成途径及其旁支黄酮类化合物和棉酚合成路径基因的转录变化,发现沉默植株木质素合成途径基因PAL,4CL,COMT,HCT,CCoAOMT和CAD的表达水平均高于对照,表明较低的木质素含量对木质素途径合成酶基因的转录水平呈负反馈;黄酮类化合物和棉酚合成相关基因CHS,CHI,DFR,F3H,F3’H,LAR,ANR和TBS表达水平高于对照。综上,本研究鉴定了陆地棉83个GhLAC成员,明确了黄萎病菌诱导下各成员的表达规律;明确了GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12四个基因的功能;初步探明了四个成员的抗黄萎病机制。
苗玉焕[8]（2019）在《色氨酸代谢与棉花抗黄萎病免疫调控》文中研究指明植物可以产生很多初生和次生代谢物以维持正常的生长发育和抵御外界环境胁迫,而这些具有防御性的代谢物质大多都来源于氨基酸合成和代谢路径。虽然棉花含有丰富的次生代谢物质,但是这些物质在棉花中的合成路径以及在棉花生长发育和防御反应中的作用并不清楚。本研究前期通过拟南芥芯片表达谱数据,并结合棉花响应黄萎病菌的RNA-Seq数据和抑制差减杂交文库,发现色氨酸合成路径基因GbTSA1受多种真菌诱导表达,推测该基因可能参与了植物广谱响应真菌侵染的抗病信号路径或免疫调控。本研究基于以上结果对色氨酸合成路径相关基因在棉花抗黄萎病中的功能进行了解析,取得主要结果如下:1.GbTSA1表达模式分析组织表达模式分析显示GbTSA1在棉花各个组织（根,茎秆,叶片,花瓣,0 d胚珠,5 d纤维）中均高量表达;诱导表达模式分析显示GbTSA1在棉花接种黄萎病菌初期表达显着下降,在接种24 h后表达显着上调,同时该基因也受水杨酸处理诱导上调表达;亚细胞定位结果显示GbTSA1基因编码的蛋白定位于叶绿体中。2.GbTSA1抑制表达材料增强棉花对黄萎病的抗性为了研究GbTSA1在棉花抗病中的功能,我们构建了GbTSA1超量表达载体,RNAi抑制表达载体以及病毒诱导的基因沉默载体,并获得超表达株系（OS-2,OS-3,OS-5,OS-8）和抑制表达株系si-1。研究发现,抑制GbTSA1表达的转基因株系si-1出现类病斑表型,同时伴随SA合成路径以及PR基因的显着激活。利用病毒载体TRV:TSA1抑制GbTSA1表达后植株表现出与si-1相似的类病斑表型。进一步研究发现,抑制GbTSA1表达后增强棉花对黄萎病菌的抗性,而超量表达GbTSA1后对棉花黄萎病的抗性影响不大。3.GbTSA1抑制表达材料表型形成依赖于水杨酸合成和信号路径为了研究si-1以及TRV:TSA1抑制表达植株类病斑的形成机制,本研究将水杨酸合成路径关键基因GbICS1以及信号路径关键基因GbNPR1分别与GbTSA1进行共抑制,结果表明共抑制GbICS1和GbNPR1后可以恢复TRV:TSA1抑制表达植株引发的类病斑及抗病的表型,说明水杨酸合成的组成型激活是导致TRV:TSA1抑制表达植株出现坏死的原因。4.吲哚激活棉花抗病免疫反应和SA合成由于色氨酸合成路径和水杨酸合成路径共用前体底物分支酸,为了解析si-1以及TRV:TSA1抑制表达植株引发水杨酸含量升高的机制,我们对整个色氨酸合成路径进行了系统的研究,结果显示类病斑表型的出现具有基因特异性,且不是由分支酸和色氨酸含量变化所致。此外,TRV:TSB1抑制表达植株也出现依赖于水杨酸信号路径的类病斑表型。酵母双杂交实验表明GbTSB1可以和GbTSA1互作形成复合体催化色氨酸合成的最后一步反应;代谢组分析发现TRV:TSA1和TRV:TSB1抑制表达植株吲哚以及吲哚类代谢物显着积累;转录组分析发现吲哚可以激活抗病相关基因以及水杨酸合成相关基因GbSARD1,GbWRKY28等的表达;双荧光素酶实验证明GbSARD1和GbWRKY28可以结合在GbICS1的启动子上,激活GbICS1的表达;共抑制GbSARD1可以部分恢复TRV:TSA1和TRV:TSB1抑制表达植株类病斑表型;吲哚外施处理显示吲哚可以增强棉花对黄萎病菌的抗性;以上结果表明,抑制GbTSA1和GbTSB1的表达能促进其代谢底物吲哚以及吲哚类物质在抑制表达植株中显着积累,吲哚类物质可以通过激活SA合成关键转录因子GbSARD1以及GbWRKY28的表达,最终导致TRV:TSA1和TRV:TSB1抑制表达植株中SA含量显着升高,PR基因组成型激活,植株出现类病斑和抗病表型。5.GbTRP1抑制表达植株积累邻氨基苯甲酸类物质本研究还发现色氨酸合成路径基因GbTRP1抑制表达植株以及GbTRP1-RNAi转基因株系也会产生类病斑表型,但在TRV:TRP1抑制表达植株中SA含量显着降低。代谢组分析发现邻氨基苯甲酸及其衍生物在TRV:TRP1抑制表达植株中显着积累。后续实验需要进一步探讨TRV:TRP1抑制表达植株和GbTRP1-RNAi转基因株系出现类病斑的机制以及邻氨基苯甲酸与水杨酸（邻羟基苯甲酸）在植物抗病反应中的联系。
张书芹[9]（2019）在《棉花PLCP基因的全基因组鉴定和GhRD21-7在抗黄萎病反应中的功能解析》文中研究指明棉花黄萎病是影响我国棉花品质和产量提高的主要病害,因此挖掘棉花抗黄萎病的关键基因以及阐明其分子作用机理非常必要。半胱氨酸蛋白酶基因C1A家族木瓜类半胱氨酸蛋白酶（papain-like cysteine proteases,PLCPs）在植物的广谱抗病中发挥着重要作用。本研究利用陆地棉TM-1分析了PLCPs的全基因组进化信息,并对家族成员GhRD21-7在棉花抗生物胁迫中的功能进行了分析,取得的主要研究结果如下:1.在陆地棉TM-1基因组中共鉴定到78个PLCPs成员。利用陆地棉和拟南芥PLCPs构建进化树,根据聚类结果所有的成员被分成了9个亚家族,分别命名为亚家族RD21、CEP、XCP、XBCP3、THI、SAG12、RD19、ALP和CTB。基因结构分析显示不同亚家族成员分别具有特异的结构和保守的motif,说明同一家族成员在进化上的保守性和功能上可能的相似性。2.PLCPs的组织表达模式分析表明PLCPs基因在花瓣和花药中表达量最高,其次是10 d纤维、种子萌发24 h的子叶、茎和开花10 d的胚珠。这些基因在柱头、子房和根中的表达量相对较低。表达模式分析表明共有35个PLCPs基因在棉花遭受高温、低温、盐和PEG处理后表达变化明显,其中在棉花遭受高温、低温、盐和PEG处理后分别有21、24、10和8个基因的表达变化明显。共有29个PLCP基因在棉花接种黄萎病菌处理后在接种材料和对照材料间表达差异明显,其中有16个PLCP基因在棉花受黄萎病菌侵染后上调表达。GhRD21-7在棉花接种黄萎病菌6 h下调表达,12 h上调表达并持续到24 h,并且它的表达量高于其它上调表达的基因。3.我们克隆了GhRD21-7,它编码长457个氨基酸的蛋白。组织表达模式表明GhRD21-7在花药中的表达量最高,其次是叶、根、茎和花瓣。为了研究GhRD21-7在棉花中的功能,我们构建了GhRD21-7的超量表达和抑制表达载体,获得了相应的超量表达GhRD21-7株系（OE154,OE173）和抑制GhRD21-7表达株系（Ri294,Ri381）。转基因株系接种黄萎病菌的结果表明超量表达GhRD21-7增强了棉花对黄萎病菌的抗性,抑制GhRD21-7表达削弱了棉花对黄萎病菌的抗性。4.转录组分析表明超量表达GhRD21-7株系OE154与野生型材料相比共有1522个差异表达基因,其中804个基因上调表达,718个基因下调表达。在接种黄萎病菌后,OE154中差异表达的基因较野生型材料多,达到2172个,其中1387个基因表达上调,785个基因表达水平下降。我们发现苯丙烷类代谢路径在差异表达基因中均富集。该代谢通路上共鉴定有17个基因,其中4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL1）,咖啡酸辅酶A甲基转移酶（CCoAOMT）,肉桂醇脱氢酶（CAD6）,肉桂酸-4-羟化酶（C4H）均与木质素合成途径相关,其中4CL和C4H是苯丙烷代谢路径的核心部分的关键酶,CCoAOMT和CAD是木质素G型和S型单体合成路径的关键酶。在接种前和接种后,4CL和C4H的表达量在超量表达GhRD21-7的转基因株系中和对照相比均上调,表明木质素代谢路径在超量表达GhRD21-7的转基因株系对黄萎病菌的抗性反应中发挥重要作用。该研究提了供棉花木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因家族成员的大量信息,为该家族成员的后续研究提供了参考。同时利用GhRD21-7的超量表达和抑制表达株系鉴定出该基因增强了棉花对黄萎病菌的抗性,利用转录组数据得出GhRD21-7介导的棉花对黄萎病菌的抗性与木质素合成路径激活有关。
李社增[10]（2018）在《大丽轮枝菌胁迫下棉花次生代谢产物质谱分析》文中研究表明棉花是世界上重要经济作物之一,由大丽轮枝菌引起的黄萎病是危害棉花的严重病害。种植抗病棉花品种是控制该病危害的根本途径,但抗源材料匮乏限制了抗黄萎病棉花品种选育速度,是亟待解决的重大问题。传统抗源材料的选择主要通过野生棉收集、远缘杂交及品种驯化等方法,效率低,远不能满足棉花抗病育种的需求。随着分子生物学的发展,更多科学家聚焦于通过分子技术调控或导入外源基因提高棉花免疫能力获得抗病品种的棉花分子育种,虽然取得了重要进展,但应用于棉花生产仍有很多科学问题需要解决。为了加快棉花分子育种效率,包括棉花与病原菌互作机理、抗病途径、病原菌致病机制等一系列关键技术成为首要解决的科学问题,明确棉花次生代谢产物及其在棉花抗病中的作用是相关重要工作之一。因此,本研究针对棉花黄萎病相关的棉花次生代谢产物开展研究,以期发现具有重要价值的病程相关次生代谢产物,为棉花分子育种提供更多的科学依据。本研究在确定了遗传背景高度一致而在田间病圃中对黄萎病抗性具有显着差异的棉花材料基础上,采用超高压液相色谱串联四级杆飞行时间质谱技术（UPLC-Q/TOF-MS）对12组棉花苗期组织样本进行了次生代谢产物检测,通过统计学方法处理数据并对各代谢产物同一品种不同处理间差异、同一处理不同品种间差异进行了分析,获得重要差异次生代谢产物,进一步采用关联分析挖掘出指纹次生代谢产物、通用病程相关次生代谢产物等重要物质,根据已有文献和数据库中有关棉花次生代谢产物数据,构建了棉花次生代谢产物专用数据库,为进一步对重要差异次生代谢产物定性制定了解决方案。主要研究结果如下:1、获得遗传背景高度一致而对棉花黄萎病抗性显着差异的棉花材料2份:转基因棉花90472-4是以棉花91079-80为受体材料,转入几丁质酶和葡聚糖酶双价基因获得的后代材料,但SSR标记分析表明二者遗传背景完全一致。通过连续2年棉花黄萎病田间病圃鉴定表明亲本棉花91079-80病情指数低于60时,转基因棉花90472-4对棉花黄萎病具有较好抗性,显着优于棉花91079-80,抗病效果达到70%以上。2、明确UPLC-Q/TOF-MS技术可以实现高通量分离和检测苗期棉花组织中的次生代谢产物:在正、负离子模式下,获得苗期棉花次生代谢产物特征离子分别为4744个和 3370个,质荷比 m/z 分别为 101.022312～1484.517108 和 100.040801～1483.382150。3、建立棉花次生代谢产物专用数据库:该数据库包括1 15个棉花次生代谢产物及其相关的准确分子量等性状,涉及萜类物质61个、酚类物质28个、脂类物质8个、含氮物质6个、有机酸物质5个、芳香烃物质1个和糖类物质6个。4、发现并挖掘出指纹次生代谢产物139个:112个为正离子模式下的棉花代谢产物特征离子,27个为负离子模式下的棉花代谢产物特征离子,这些物质在亲本棉花和转基因后代棉花中含量呈倍性增减,品种间比值变化方向较为稳定,不受不同处理的影响,是重要的品种间差异性生物标志,是区分2个供试棉花品种身份的潜在苗期棉花代谢产物5、发现并挖掘出通用病程相关代谢产物228个:184个为正离子模式下的棉花代谢产物特征离子,44个为负离子模式下的棉花代谢产物特征离子,这些物质含量在病原菌侵染处理和自然发育处理间呈倍性增减,处理间具有稳定的倍性变化方向,不受供试品种差异的影响,是重要的处理间差异性生物标志,是潜在的病程相关代谢产物。6、明确指纹代谢产物和病程相关代谢产物分布具有组织特异性,可能由这些物质的生理作用所决定:作为病程相关代谢产物的根部和茎部指纹代谢产物绝大多数分布在根部,而作为病程相关代谢产物的叶部指纹代谢产物分布具有一定的多样性,单独或同时分布在根茎中,并没出现在叶部本身。推测这可能与指纹代谢产物在根、茎、叶中均能合成,但由于病原菌侵染,这些物质优先运输和储存在根和茎中,其中根尤为重要,是寄主与病原菌互作的优先场所。7、推定明确49个重要次生代谢产物的物质种类:38个正离子模式下重要次生代谢产物特征离子与棉花次生代谢产物专用数据库的物质建立匹配关系,对应其中的74个次物质,其中属于萜类物质59个次（倍半萜最多46个次）,脂类、糖类和有机酸类物质各1个,酚类物质12个（生物碱5个次,黄酮类6个次,苯酚1个次）。11个负离子模式下重要次生代谢产物特征离子与棉花次生代谢产物专用数据库的物质建立匹配关系,对应18个物质,其中属于萜类物质15个次（倍半萜10个次、二萜1个、三萜3个次,杜松烷倍半萜1个）,脂类1个,有机酸类物质2个。通过本项目的研究,所获结果不仅丰富了棉花代谢组学研究数据,而且为进一步通过次生代谢产物鉴定棉花品种的身份及其抗病性提供了科学依据、为基于分子调控技术改造棉花免疫能力进而达到抗病棉花品种高效选育目标奠定了一定的理论基础。
二、棉花抗黄萎病研究取得重大成果（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、棉花抗黄萎病研究取得重大成果（论文提纲范文）
（1）海岛棉GbWRKY1基因抗黄萎病的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 棉花抗黄萎病概况 |
| 1.1.1 棉花黄萎病及其防治现状 |
| 1.1.2 棉花黄萎病菌的致病机理 |
| 1.2 棉花抗黄萎病机制 |
| 1.2.1 植物的先天免疫系统 |
| 1.2.2 水杨酸、茉莉酸、乙烯介导的信号通路 |
| 1.2.3 棉花对黄萎病菌的组织结构抗性 |
| 1.2.4 棉花对黄萎病菌的生理生化抗性 |
| 1.3 植物WRKY家族基因研究进展 |
| 1.3.1 植物WRKY转录因子家族 |
| 1.3.2 WRKY转录因子的功能研究 |
| 1.4 本研究目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试植物材料 |
| 2.1.2 实验所需仪器和生化试剂 |
| 2.1.3 载体和菌株 |
| 2.1.4 试验中主要溶液配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 棉花抗、感两个品种WRKY1 基因的克隆 |
| 2.2.2 WRKY1 的生物信息学分析 |
| 2.2.3 棉花抗感两个品种WRKY1 基因启动子的克隆 |
| 2.2.4 WRKY1 基因上游顺式作用元件分析 |
| 2.2.5 WRKY1 的实时荧光定量表达模式分析 |
| 2.2.6 在Pima90-53 中沉默GbWRKY1 |
| 2.2.7 VIGS沉默GbWRKY1 后的抗病性鉴定 |
| 2.2.8 GbWRKY1 沉默植株的信号通路相关基因的表达分析 |
| 2.2.9 超表达GbWRKY1 基因拟南芥植株的功能验证 |
| 2.2.10 数据分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 棉花抗、感两个品种WRKY1 基因编码区全长序列的克隆与生信分析 |
| 3.1.1 棉花抗、感两个品种WRKY1 基因编码区全长序列的克隆 |
| 3.1.2 棉花抗、感两个品种WRKY1 基因编码区全长序列比对分析 |
| 3.1.3 WRKY1 蛋白三级结构预测 |
| 3.2 棉花抗、感两个品种WRKY1 启动子的克隆及顺式作用元件分析 |
| 3.2.1 棉花抗、感两个品种WRKY1 启动子的克隆 |
| 3.2.2 棉花抗、感两个品种WRKY1 基因启动子顺式作用元件分析 |
| 3.3 棉花抗、感两个品种WRKY1 表达模式分析 |
| 3.4 利用VIGS技术沉默GbWRKY1 后的棉花抗病性分析 |
| 3.4.1 VIGS 载体 pYL156-GbWRKY1 的构建和农杆菌的转化 |
| 3.4.2 GbWRKY1 基因的沉默效果检测 |
| 3.4.3 GbWRKY1在Pima90-53 中沉默后的抗病性鉴定 |
| 3.4.4 SA、JA和 ET信号通路相关基因表达分析 |
| 3.5 转GbWRKY1 基因拟南芥T_3代纯合株系的功能验证 |
| 3.5.1 转GbWRKY1 基因拟南芥的抗病性鉴定 |
| 3.5.2 PR4、PR5和ACS2 基因的表达分析 |
| 3.5.3 Gb WRKY1 过表达对植株根长、POD 活性和木质素含量的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 GbWRKY1和GhWRKY1 基因编码区全长序列和启动子序列差异分析. |
| 4.2 GbWRKY1 基因抗黄萎病功能分析 |
| 4.3 GbWRKY1 通过影响 POD 活性和木质素含量参与抗黄萎病反应过程 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
（2）陆地棉候选感黄萎病基因的克隆及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 棉花黄萎病 |
| 1.1.1 棉花黄萎病的危害 |
| 1.1.2 棉花黄萎病菌的致病机理 |
| 1.1.3 棉花抗黄萎病机制 |
| 1.2 植物感病基因的研究 |
| 1.2.1 感病基因的定义 |
| 1.2.2 感病基因的发掘 |
| 1.2.3 感病基因的应用 |
| 1.3 基因功能的研究技术 |
| 1.3.1 病毒诱导的基因沉默技术 |
| 1.3.2 RACE技术 |
| 1.3.3 亚细胞定位 |
| 1.3.4 基因的过表达技术 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 目的基因的表达模式分析 |
| 2.1 试验材料与试剂 |
| 2.1.1 棉花品种与病菌 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 试剂盒 |
| 2.1.4 试剂的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 陆地棉的种植及培养 |
| 2.2.2 病菌的培养及活化 |
| 2.2.3 不同处理的陆地棉取样 |
| 2.2.4 荧光定量引物合成 |
| 2.2.5 不同抗病品种样品RNA的提取及反转录 |
| 2.2.6 陆地棉不同组织样品RNA的提取及反转录 |
| 2.2.7 植物激素处理后样品RNA的提取及反转录 |
| 2.2.8 荧光定量PCR |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同抗病品种中目的基因的表达模式 |
| 2.3.2 植物激素处理后的表达模式 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 VIGS技术验证基因的抗黄萎病能力 |
| 3.1 试验材料与试剂 |
| 3.1.1 棉花品种与病菌 |
| 3.1.2 载体与菌株 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 试剂盒与试剂 |
| 3.1.5 试验试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 棉株的种植及培养 |
| 3.2.2 克隆VIGS目的基因片段 |
| 3.2.3 沉默载体构建 |
| 3.2.4 重组VIGS载体转化农杆菌 |
| 3.2.5 棉株的接种 |
| 3.2.6 沉默棉株的目的基因表达量分析 |
| 3.2.7 病菌的活化及接种 |
| 3.2.8 沉默植株的抗病性鉴定 |
| 3.2.9 台盼蓝染色 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 沉默载体的构建 |
| 3.3.2 VIGS沉默棉株的表型 |
| 3.3.3 目的基因的表达量测定 |
| 3.3.4 沉默植株抗病性鉴定 |
| 3.4 台盼蓝染色 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 候选感黄萎病基因GhBZR1、GhWRKY74和GhTGA7的全长克隆 |
| 4.1 试验材料与试剂 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 所需仪器设备 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 陆地棉86-1 的种植 |
| 4.2.2 RNA的提取 |
| 4.2.3 cDNA的合成 |
| 4.2.4 引物设计 |
| 4.2.5 GhBZR1、GhWRKY74 全长克隆 |
| 4.2.6 GhTGA7 全长克隆 |
| 4.2.7 GhBZR1、GhWRKY74和GhTGA7 的生物信息学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 基因GhBZR1 的克隆及生物信息分析 |
| 4.3.2 基因GhWRKY74 的克隆及生物信息分析 |
| 4.3.3 基因GhTGA7 的克隆及生物信息分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 基因GhBZR1、GhWRKY74和GhTGA7 的亚细胞定位分析 |
| 5.1 试验材料与试剂 |
| 5.1.1 植物材料与载体 |
| 5.1.2 仪器设备 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 植物材料的种植 |
| 5.2.2 目的基因的克隆 |
| 5.2.3 亚细胞定位载体构建 |
| 5.2.4 亚细胞定位载体35S::GhX-GFP转化农杆菌 |
| 5.2.5 烟草接种及结果观察 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 亚细胞定位载体的构建 |
| 5.3.2 激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 超表达技术研究GhBZR1 基因功能 |
| 6.1 材料于试剂 |
| 6.1.1 植物材料与病菌 |
| 6.1.2 载体与菌株 |
| 6.1.3 仪器设备 |
| 6.1.4 试剂盒与试剂 |
| 6.1.5 试剂的配制 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 GhBZR1 目的片段扩增 |
| 6.2.2 超表达载体构建 |
| 6.2.3 超表达载体pPZP111-eGFP-GhBZR1 转化农杆菌 |
| 6.2.4 拟南芥遗传转化 |
| 6.2.5 阳性苗筛选 |
| 6.2.6 基因GhBZR1 的表达分析 |
| 6.2.7 超表达植物的抗病性鉴定 |
| 6.2.8 转基因拟南芥抗病相关基因的表达 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 基因GhBZR1 超表达载体的构建 |
| 6.3.2 转基因拟南芥的筛选 |
| 6.3.3 超表达拟南芥黄萎病的抗性鉴定 |
| 6.3.4 超表达拟南芥抗性相关基因的表达分析 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）棉花陆海渐渗系群体的产量品质、抗黄萎病QTL挖掘及qVW-5-1的精细定位（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 棉花黄萎病抗性研究进展 |
| 1.1.1 病原菌及为害 |
| 1.1.2 黄萎病侵染棉花的过程 |
| 1.1.3 棉花的防御反应 |
| 1.2 染色体片段渐渗系及QTL定位研究进展 |
| 1.2.1 染色体片段渐渗系的构建 |
| 1.2.2 染色体片段渐渗系的特点 |
| 1.2.3 染色体片段渐渗系用于定位的研究进展 |
| 1.3 转录组测序技术 |
| 1.3.1 高通量测序技术 |
| 1.3.2 转录组测序的过程 |
| 1.3.3 棉花黄萎病相关转录组学研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 陆海渐渗系MBI9626 纤维产量、品质和黄萎病抗性相关QTL的挖掘 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 亲本材料与群体构建 |
| 2.1.2 基因组DNA提取 |
| 2.1.3 分子标记的检测 |
| 2.1.4 数量性状的测定 |
| 2.1.5 统计分析和遗传图谱的构建 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 表型性状描述性分析 |
| 2.2.2 表型相关性分析 |
| 2.2.3 基因型分析 |
| 2.2.4 QTL定位分析 |
| 2.2.5 QTL簇的分布 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 染色体片段代换系群体适合QTL定位 |
| 2.3.2 稳定QTL的鉴定 |
| 2.3.3 增效基因的来源 |
| 2.3.4 QTL簇的加性效应方向 |
| 第三章 qVW-05-1 精细定位 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 定位区间的标记加密 |
| 3.1.2 重组单株的筛选 |
| 3.1.3 精细定位群体的构建与性状调查 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 qVW-05-1 区间加密 |
| 3.2.2 含qVW-05-1 片段的重组单株 |
| 3.2.3 qVW-05-1 精细定位 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 SSR标记在定位中的应用 |
| 3.3.2 黄萎病抗性的鉴定 |
| 3.3.3 统计功效 |
| 第四章 棉花黄萎病抗性转录组测序分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 RNA-seq测序质量 |
| 4.2.2 DEGs的筛选与分析 |
| 4.2.3 基因时序表达模式分析 |
| 4.2.4 候选基因的分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 抗病相关基因的表达调控 |
| 4.3.2 转录组测序辅助精细定位 |
| 4.3.3 候选基因分析 |
| 4.3.4 后期工作展望 |
| 第五章 全文结论 |
| 5.1 MBI9626 纤维产量、品质和黄萎病抗性相关QTL的挖掘 |
| 5.2 qVW-5-1 的精细定位 |
| 5.3 转录组分析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）海岛棉GST基因家族遗传进化及关键直系同源基因抗黄萎病功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 本文所用缩略词及中文对照 |
| 1 引言 |
| 1.1 棉花黄萎病 |
| 1.2 棉花黄萎病致病机制 |
| 1.3 棉花抗黄萎病的研究进展 |
| 1.4 谷胱甘肽硫转移酶基因研究进展 |
| 1.5 病毒诱导的基因沉默技术 |
| 1.6 酵母双杂交 |
| 1.7 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 载体与菌株 |
| 2.1.3 生化试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 基因组数据来源 |
| 2.2.2 生物信息学分析 |
| 2.2.3 植物材料的种植 |
| 2.2.4 RNA提取及RT-PCR检测 |
| 2.2.5 pTR V2-GbGST16930载体的构建 |
| 2.2.6 VIGS沉默GbGST16930基因 |
| 2.2.7 35s:GhGST1510载体的构建及转化拟南芥 |
| 2.2.8 超表达拟南芥纯系的获得及抗性鉴定 |
| 2.2.9 GhGST1510蛋白的原核表达 |
| 2.2.10 GhGST1510蛋白的亚细胞定位 |
| 2.2.11 酵母双杂交 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 棉花GST基因家族的生物信息学分析 |
| 3.1.1 海岛棉GST基因的鉴定 |
| 3.1.2 海岛棉GST基因的染色体定位分析 |
| 3.1.3 海岛棉GST基因的串联重复分析 |
| 3.1.4 海岛棉GST基因结构分析 |
| 3.1.5 Tau类GST基因的系统进化分析 |
| 3.1.6 海岛棉GST基因家族Circle mapping分析 |
| 3.2 沉默GbGST16930基因对棉花黄萎病抗性的鉴定 |
| 3.3 GhGST1510基因生物信息学分析 |
| 3.4 超表达载体的构建及纯系的获得 |
| 3.5 超表达拟南芥抗性鉴定 |
| 3.6 GhGST1510原核表达结果与分析 |
| 3.7 GhGST1510亚细胞定位结果与分析 |
| 3.8 GhGST1510蛋白酵母双杂交结果与分析 |
| 3.8.1 诱饵载体的构建及转化 |
| 3.8.2 自激活及毒性检测 |
| 3.8.3 GhGST1510互作蛋白筛选 |
| 3.9 互作基因的KEGG和GO分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 海岛棉D09号染色体tau类cluster的遗传进化 |
| 4.2 陆地棉中GhGST1510基因的抗病功能与分子机制 |
| 4.3 棉花体内抗黄萎病代谢途径分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 论文录用通知 |
（5）Gh4CL30和GhWRKY70D13在棉花抗黄萎病中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物抗病机制研究进展 |
| 1.2 棉花黄萎病及其防治 |
| 1.2.1 棉花黄萎病及其危害 |
| 1.2.2 棉花黄萎病菌的侵染过程和致病机理 |
| 1.2.3 棉花黄萎病防治技术 |
| 1.3 棉花黄萎病抗性机制研究 |
| 1.3.1 次生代谢产物在棉花与黄萎病菌互作中的作用 |
| 1.3.2 植物激素在棉花与黄萎病菌互作中的作用 |
| 第二章 棉花黄萎病菌胁迫后的转录组学研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料、菌株 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 棉花材料的准备 |
| 2.2.2 黄萎病病原菌的活化、培养和接种 |
| 2.2.3 棉花材料抗病性鉴定 |
| 2.2.4 黄萎病菌恢复培养和真菌相对含量检测 |
| 2.2.5 棉花总RNA的提取和质量检测 |
| 2.2.6 cDNA文库构建及转录组测序 |
| 2.2.7 数据质量评估与差异表达基因筛选 |
| 2.2.8 差异表达基因GO和 KEGG富集分析 |
| 2.2.9 加权基因共表达网络分析(WGCNA) |
| 2.2.10 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证转录组测序结果 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 陆地棉品种SD和 JM抗病性鉴定 |
| 2.3.2 测序数据质量评估及可靠性验证 |
| 2.3.3 接种黄萎病菌前SD和 JM之间差异表达基因挖掘 |
| 2.3.4 SD和 JM之间差异基因WGCNA分析 |
| 2.3.5 SD和 JM之间的差异基因参与棉花响应黄萎病菌侵染 |
| 2.3.6 SD和 JM接种黄萎病菌后差异基因筛选 |
| 2.3.7 SD和 JM接种黄萎病菌后差异基因GO和 KEGG富集分析 |
| 2.3.8 木质素合成相关基因参与棉花响应黄萎病菌侵染 |
| 2.3.9 激素与棉花抗病反应 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 棉花响应黄萎病菌侵染转录组学研究 |
| 2.4.2 木质素参与棉花抗黄萎病反应 |
| 2.4.3 植物激素参与棉花抗黄萎病反应 |
| 第三章 Gh4CL30 在棉花抗黄萎病中的功能验证 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料、菌株及载体 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 棉花材料的准备 |
| 3.2.2 棉花黄萎病菌的活化、培养和接种 |
| 3.2.3 RNA提取、反转录以及qRT-PCR分析 |
| 3.2.4 病毒诱导的基因沉默(VIGS) |
| 3.2.5 棉花接种黄萎病菌后发病率及病情指数统计 |
| 3.2.6 黄萎病菌恢复培养和真菌相对含量检测 |
| 3.2.7 木质素组织化学染色 |
| 3.2.8 棉花总木质素和木质素单体含量测定 |
| 3.2.9 棉花内源SA和 JA含量测定 |
| 3.2.10 棉花总黄酮含量测定 |
| 3.2.11 棉花茎秆甲醇提取物的抑菌性鉴定 |
| 3.2.12 HPLC-MS/MS法测量棉花咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸和香豆酸含量 |
| 3.2.13 咖啡酸和阿魏酸抑菌性测定 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 Gh4CL30 组织表达与黄萎病菌诱导表达模式分析 |
| 3.3.2 沉默Gh4CL30 对棉花黄萎病抗性的影响 |
| 3.3.3 Gh4CL30 沉默植株中木质素含量变化 |
| 3.3.4 Gh4CL30 沉默植株中木质素单体含量变化 |
| 3.3.5 沉默Gh4CL30对SA和 JA信号通路的影响 |
| 3.3.6 Gh4CL30 沉默对黄酮的生物合成的影响 |
| 3.3.7 Gh4CL30 沉默植株茎秆中出现红棕色物质积累 |
| 3.3.8 Gh4CL30 沉默植株抗病性增强与咖啡酸和阿魏酸的关系 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 沉默Gh4CL30 改变木质素的生物合成 |
| 3.4.2 Gh4CL30 沉默抑制SA和 JA信号通路和黄酮生物合成 |
| 3.4.3 咖啡酸和阿魏酸的积累有助于提高Gh4CL30 沉默植株抗病性 |
| 第四章 GhWRKY70D13 在棉花抗黄萎病中的功能分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 植物材料、菌株及载体 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 棉花GhWRKY70 家族基因的查找和生物信息学分析 |
| 4.2.2 棉花GhWRKY70 家族基因启动子顺式作用原件分析 |
| 4.2.3 棉花材料的准备 |
| 4.2.4 黄萎病病原菌菌的活化、培养和接种 |
| 4.2.5 水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯利处理棉花 |
| 4.2.6 RNA提取、反转录以及qRT-PCR分析 |
| 4.2.7 病毒诱导的基因沉默(VIGS) |
| 4.2.8 棉花接种黄萎病菌后发病率及病情指数统计 |
| 4.2.9 黄萎病菌恢复培养和真菌相对含量检测 |
| 4.2.10 GhWRKY70A05a、GhWRKY70A06及Gh WRKY70D13 基因的克隆 |
| 4.2.11 GhWRKY70D13 基因干扰表达载体构建及棉花遗传转化 |
| 4.2.12 黄萎病菌处理后GhWRKY70D13 干扰材料的转录组分析 |
| 4.2.13 差异表达基因KEGG富集分析 |
| 4.2.14 HPLC-MS/MS法测量棉花内源1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)、SA和 JA含量 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 陆地棉GhWRKY70 家族基因的全基因鉴定 |
| 4.3.2 陆地棉GhWRKY70 家族基因结构域和进化分析 |
| 4.3.3 陆地棉GhWRKY70 家族基因启动子顺式作用原件分析 |
| 4.3.4 陆地棉GhWRKY70 家族基因的组织表达模式分析 |
| 4.3.5 陆地棉GhWRKY70 家族基因在不同激素处理表达模式分析 |
| 4.3.6 陆地棉GhWRKY70 家族在黄萎病菌接种后表达模式分析 |
| 4.3.7 TRV:GhWRKY70D13 干涉植株提高棉花对黄萎病的抗性 |
| 4.3.8 GhWRKY70D13-RNAi转基因棉花抗病性鉴定 |
| 4.3.9 抑制表达GhWRKY70D13 后的转录组分析 |
| 4.3.10 抑制GhWRKY70D13 表达激活ET信号通路 |
| 4.3.11 抑制GhWRKY70D13 表达对JA信号通路的影响 |
| 4.3.12 抑制GhWRKY70D13 表达降低SA的生物合成 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论、创新点与展望 |
| 5.1 全文结论 |
| 5.2 全文创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（6）GhSDH1-1正向调控棉花对黄萎病抗性的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 棉花黄萎病 |
| 1.1.1 棉花黄萎病及危害 |
| 1.1.2 棉花黄萎病致病机制 |
| 1.1.3 棉花黄萎病抗性机制 |
| 1.1.4 防御机制中重要的信号传导途径 |
| 1.2 琥珀酸脱氢酶与植物抗病性 |
| 1.2.1 琥珀酸脱氢酶研究背景 |
| 1.2.2 琥珀酸脱氢酶与活性氧 |
| 1.2.3 琥珀酸脱氢酶与SA信号通路 |
| 1.3 研究的目的及意义 |
| 第二章 GhSDH1-1基因的克隆与分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料、引物、载体与菌株 |
| 2.1.2 酶、试剂盒、仪器与其他耗材 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 棉花样本处理及总RNA的提取 |
| 2.2.2 cDNA的合成 |
| 2.2.3 SDH相关基因的聚类分析与q RT-PCR检测 |
| 2.2.4 GhSDH1-1基因的克隆、回收 |
| 2.2.5 分析 |
| 2.2.6 载体构建 |
| 2.2.7 亚细胞定位操作 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 SDH相关基因的聚类分析与q RT-PCR检测结果 |
| 2.3.2 GhSDH1-1基因序列及结构分析 |
| 2.3.3 构建GFP-SDH1-1 载体 |
| 2.3.4 亚细胞定位结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 GhSDH1-1在棉花上的功能验证 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物、菌株等材料 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 VIGS载体构建 |
| 3.2.2 农杆菌转化法侵染棉花 |
| 3.2.3 接种大丽轮枝菌 |
| 3.2.4 病情指数调查 |
| 3.2.5 真菌恢复试验 |
| 3.2.6 叶片死细胞检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 VIGS载体构建 |
| 3.3.2 基因沉默后的抗病性检测 |
| 3.3.3 真菌恢复试验结果 |
| 3.3.4 叶片死细胞检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 GhSDH1-1在棉花中的抗病机制 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 琥珀酸和富马酸的检测 |
| 4.2.2 抗病相关基因的表达 |
| 4.2.3 活性氧检测 |
| 4.2.4 棉花根部SA含量检测 |
| 4.2.5 荧光定量检测SA处理后的Gh SDH1-1 表达量 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 琥珀酸和富马酸的检测结果 |
| 4.3.2 抗病相关基因的表达量 |
| 4.3.3 活性氧检测结果 |
| 4.3.4 棉花根部SA含量检测结果 |
| 4.3.5 荧光定量检测SA处理后的Gh SDH1-1 表达量结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 GhSDH1-1在拟南芥中的功能验证 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 过表达载体的构建 |
| 5.2.2 拟南芥的种植与转化 |
| 5.2.3 转基因拟南芥的筛选与鉴定 |
| 5.2.4 拟南芥接菌与抗病性观察 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 过表达载体的构建 |
| 5.3.2 转基因拟南芥株系的筛选与鉴定 |
| 5.3.3 抗病性检测 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 外施琥珀酸、富马酸影响棉花抗病性 |
| 6.1 材料 |
| 6.2 方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 全文结论及展望 |
| 7.1 全文结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）陆地棉GhLAC家族鉴定及候选基因抗黄萎病功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1.引言 |
| 1.1 棉花黄萎病的致病机理 |
| 1.2 黄萎病菌激发的棉花抗病防御机制 |
| 1.2.1 植物天然免疫防御机制 |
| 1.2.2 木质素合成途径关键基因的抗病研究进展 |
| 1.2.3 黄酮类化合物及棉酚合成途径关键基因的抗病研究进展 |
| 1.2.4 参与植物抗病的防御酶类及信号分子研究进展 |
| 1.2.5 漆酶基因研究进展 |
| 1.3 VIGS技术的发展及其应用 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 试验材料和试剂 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 载体和菌株 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 棉苗种植 |
| 2.2.2 黄萎病菌培养 |
| 2.2.3 棉苗接黄萎病菌及取样 |
| 2.2.4 棉苗激素处理与取样 |
| 2.2.5 组织特异表达分析及取样 |
| 2.2.6 陆地棉TM-1 三代基因组LAC基因家族的鉴定及理化性质分析 |
| 2.2.7 陆地棉漆酶家族的系统进化分析 |
| 2.2.8 陆地棉漆酶基因家族的结构和保守域分析 |
| 2.2.9 陆地棉漆酶基因家族在黄萎病胁迫下的表达分析 |
| 2.2.10 候选基因编码蛋白的理化性质分析 |
| 2.2.11 候选基因编码蛋白的亲水性、信号肽、跨膜域和亚细胞预测分析 |
| 2.2.12 候选基因漆酶蛋白的保守结构域分析 |
| 2.2.13 候选基因上游顺式作用元件分析 |
| 2.2.14 RNA的提取及检测 |
| 2.2.15 cDNA的合成 |
| 2.2.16 荧光实时定量PCR |
| 2.2.17 VIGS引物设计 |
| 2.2.18 PCR反应及VIGS载体构建 |
| 2.2.19 H2O2及NO含量测定 |
| 2.2.20 POD及 SOD活力测定 |
| 2.2.21 BCA蛋白浓度测定 |
| 2.2.22 木质素染色及含量测定 |
| 2.2.23 VIGS注射及病指调查 |
| 2.2.24 接菌后根部、茎部观察 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 陆地棉LAC基因家族生物信息学分析 |
| 3.1.1 陆地棉LAC基因家族成员的鉴定 |
| 3.1.2 陆地棉漆酶基因系统发育分析 |
| 3.1.3 陆地棉漆酶基因家族的结构和保守基序分析 |
| 3.1.4 陆地棉漆酶基因家族在黄萎病胁迫下的表达分析 |
| 3.2 陆地棉中四个候选漆酶基因的生物信息学分析 |
| 3.2.1 候选基因编码蛋白的理化性质分析 |
| 3.2.2 候选基因编码蛋白的亲水性、信号肽、跨膜域和亚细胞预测分析 |
| 3.2.3 候选基因漆酶蛋白的保守结构域分析 |
| 3.2.4 候选基因上游顺式作用元件分析 |
| 3.3 实时定量PCR分析相对表达量 |
| 3.3.1 组织特异表达分析 |
| 3.3.2 受黄萎病诱导的表达分析 |
| 3.3.3 受MeJA和 SA诱导表达分析 |
| 3.4 VIGS试验 |
| 3.4.1 LAC基因VIGS载体构建及农杆菌转化 |
| 3.4.2 GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12 沉默效果检测 |
| 3.4.3 VIGS沉默后接黄萎病菌抗病性鉴定 |
| 3.4.4 接菌后H2O2含量变化 |
| 3.4.5 接菌后NO含量变化 |
| 3.4.6 接菌后POD活力变化 |
| 3.4.7 接菌后SOD活力变化 |
| 3.4.8 木质素染色及含量测定 |
| 3.4.9 木质素合成途径关键酶基因表达分析 |
| 3.4.10 黄酮类、棉酚合成途径关键酶基因表达分析 |
| 4.讨论 |
| 4.1 陆地棉LAC基因家族鉴定及表达分析 |
| 4.2 GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12 生信分析 |
| 4.3 GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12 抗病功能分析 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 试验中所用载体结构示意图 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（8）色氨酸代谢与棉花抗黄萎病免疫调控（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 植物抗病机制 |
| 1.1.1 植物先天免疫系统 |
| 1.1.2 植物超敏反应和类病斑突变体参与的抗病反应 |
| 1.1.3 植物氨基酸代谢参与的抗病反应 |
| 1.1.4 植物激素水杨酸介导的抗病反应 |
| 1.2 棉花黄萎病及抗病机制解析 |
| 1.2.1 棉花黄萎病菌致病机制 |
| 1.2.2 棉花对黄萎病菌的组织结构抗性 |
| 1.2.3 棉花中R基因介导的抗性及机制解析 |
| 1.2.4 激素信号路径在棉花抗黄萎病菌中的作用 |
| 1.2.5 次生代谢物质在棉花抗黄萎病菌中的作用 |
| 1.3 色氨酸合成和代谢路径在植物抗病中的作用 |
| 1.3.1 色氨酸合成路径研究进展 |
| 1.3.2 色氨酸代谢路径在抗病和抗虫反应中的作用 |
| 1.4 研究问题的由来与意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料,载体和菌株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 GbTSA1 基因的分离和克隆 |
| 2.2.2 载体构建 |
| 2.2.3 棉花遗传转化 |
| 2.2.4 棉花核酸提取和Southern杂交 |
| 2.2.5 反转录以及RT-qPCR基因表达量分析 |
| 2.2.6 黄萎病菌的活化和培养、接种、病指统计、恢复培养 |
| 2.2.7 水杨酸,色氨酸,吲哚处理棉花 |
| 2.2.8 病毒诱导的基因沉默(VIGS) |
| 2.2.9 HPLC-MS法测量棉花内源激素,色氨酸,以及分支酸含量 |
| 2.2.10 GC-MS法测量吲哚含量 |
| 2.2.11 GbTSA1 基因亚细胞定位 |
| 2.2.12 酵母双杂交和双荧光素酶报告实验 |
| 2.2.13 吲哚处理转录组分析 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 GbTSA1 基因的克隆及分子检测 |
| 3.1.1 棉花中Gb TSA1 基因的分离和克隆 |
| 3.1.2 GbTSA1 基因蛋白亚细胞定位,组织表达模式和诱导表达模式 |
| 3.2 GbTSA1 转基因材料的表型鉴定 |
| 3.2.1 GbTSA1 转基因株系的获得及表型鉴定 |
| 3.2.2 TRV:TSA1 抑制表达植株表型鉴定 |
| 3.3 GbTSA1 超表达转基因植株和抑制表达植株抗病性鉴定 |
| 3.4 GbTSA1-RNAi以及TRV:TSA1 植株类病斑形成依赖于SA合成和信号转导路径 |
| 3.4.1 共沉默Gb ICS1或GbNPR1 抑制TRV:TSA1 植株类病斑表型 |
| 3.4.2 共沉默GbICS1或Gb NPR1 抑制TRV:TSA1 植株抗病表型 |
| 3.4.3 外施SA可以显着增强棉花对黄萎病菌的抗性 |
| 3.5 类病斑表型在色氨酸合成路径中具有基因特异性且不依赖于色氨酸 |
| 3.5.1 色氨酸合成路径基因在棉花中的克隆和挖掘 |
| 3.5.2 TRV:Trp-synthesis related genes抑制表达植株的表型鉴定 |
| 3.5.3 外施色氨酸不能抑制TRV:TRP1,TRV:TSA1,TRV:TSB1 植株类病斑表型 |
| 3.6 TRV:TSB1 抑制表达植株类病斑表型依赖于SA信号路径 |
| 3.7 外源施加吲哚可以增强植物抗病反应以及SA信号路径 |
| 3.7.1 TRV:TSA1和TRV:TSB1 抑制表达植株吲哚以及吲哚类衍生物含量测定.. |
| 3.7.2 外源施加吲哚增强棉花对黄萎病菌的抗性 |
| 3.7.3 吲哚处理转录组分析 |
| 3.7.4 吲哚激活SA合成相关转录因子GbSARD以及GbWRKY28 的表达 |
| 3.7.5 外源施加吲哚不能抑制黄萎病菌的生长 |
| 3.8 GbTRP1-RNAi和 TRV:TRP1 抑制表达植株增强棉花对黄萎病菌以及灰霉的抗性 |
| 3.9 TRV:TRP1 抑制表达植株中积累大量邻氨基苯甲酸类物质 |
| 3.10 TRV:Trp-synthesis related genes植株类病斑表型以及抗病表型形成机制总结 |
| 4 讨论 |
| 4.1 VIGS技术在候选基因功能验证中的作用 |
| 4.2 色氨酸合成和代谢路径与SA信号路径之间的关系 |
| 4.3 植物类病斑突变体与SA信号路径之间的关系 |
| 4.4 邻氨基苯甲酸类物质具有抑菌作用 |
| 4.5 吲哚类代谢物质在棉花抗黄萎病中的作用 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 载体构建 |
| 附录2 DNA提取 |
| 附录3 Sourthern杂交(地高辛标记法) |
| 附录4 棉花RNA提取 |
| 附录5 培养基配方 |
| 附录6 酵母双杂交实验 |
| 附录7 原生质体分离和转化以及双荧光素酶报告基因检测 |
| 附表 |
| 攻读学位期间已发表的论文和待发表的论文 |
| 申请专利 |
| 致谢 |
（9）棉花PLCP基因的全基因组鉴定和GhRD21-7在抗黄萎病反应中的功能解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 植物与病原菌的相互作用 |
| 1.1.1 植物的先天免疫系统 |
| 1.1.2 水杨酸和茉莉酸介导的植物抗病反应机制 |
| 1.2 棉花与黄萎病菌的相互作用 |
| 1.2.1 黄萎病及黄萎病菌的致病机理 |
| 1.2.2 棉花抗黄萎病遗传机制 |
| 1.2.3 棉花对黄萎病菌的组织结构抗性和生理生化抗性 |
| 1.2.4 Ve1在棉花抗黄萎病菌中的作用 |
| 1.2.5 激素信号路径在棉花抗黄萎病菌中的作用 |
| 1.2.6 质外体免疫在棉花抗黄萎病菌中的作用 |
| 1.3 植物与害虫的相互作用 |
| 1.4 木瓜类半胱氨酸蛋白酶的研究进展 |
| 1.4.1 木瓜类半胱氨酸蛋白酶的分类和结构 |
| 1.4.2 木瓜类半胱氨酸蛋白酶的功能 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 载体和菌株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 陆地棉PLCPs家族的全基因组鉴定 |
| 2.2.2 系统进化树、基因结构及定位、保守序列及蛋白特征分析 |
| 2.2.3 基因的表达模式分析 |
| 2.2.4 GhRD21-7基因的克隆 |
| 2.2.5 载体的构建 |
| 2.2.6 DNA提取和Southern杂交检测 |
| 2.2.7 RNA提取、反转录和实时定量PCR分析(qRT-PCR) |
| 2.2.8 黄萎病菌的接种检测 |
| 2.2.9 病情指数统计 |
| 2.2.10 病株剖杆和病原菌恢复培养 |
| 2.2.11 灰霉接种检测 |
| 2.2.12 斜纹夜蛾和棉铃虫的接虫实验 |
| 2.2.13 酵母双杂实验 |
| 2.2.14 转录组分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 陆地棉PLCPs家族的鉴定 |
| 3.2 陆地棉PLCPs家族的进化分析、保守基序和结构分析 |
| 3.3 陆地棉PLCP基因家族的表达量分析 |
| 3.3.1 陆地棉中PLCP基因家族的组织表达模式 |
| 3.3.2 陆地棉中PLCP基因家族的逆境表达变化分析 |
| 3.3.3 陆地棉中PLCP基因家族在接种黄萎病菌后的表达变化分析 |
| 3.3.4 陆地棉中PLCP同源基因对的表达变化分析 |
| 3.4 陆地棉GhRD21-7基因及其启动子的序列分析 |
| 3.5 陆地棉GhRD21-7基因的组织表达模式和激素、黄萎病菌处理表达模式 |
| 3.6 GhRD21-7稳定转基因株系的获得和检测 |
| 3.7 超量表达GhRD21-7增强了棉花对黄萎病菌抗性 |
| 3.8 GhRD21-7转基因材料对灰霉抗性不显着 |
| 3.9 GhRD21-7转基因材料对鳞翅目害虫抗性不显着 |
| 3.10 超量表达GhRD21-7的株系对黄萎病菌抗性增强不依赖于茉莉酸信号路径和水杨酸信号路径 |
| 3.11 GhRD21-7有自激活效应 |
| 3.12 超量表达GhRD21-7后的转录组分析 |
| 3.12.1 测序质控总览 |
| 3.12.2 样本的相关性分析 |
| 3.12.3 差异表达基因筛选 |
| 3.12.4 OE154_Mock vs WT_Mock中差异表达基因的分析 |
| 3.12.5 OE154_V991 vs WT_V991中差异表达基因的分析 |
| 3.12.6 OE154(V991 vs Mock)vs WT(V991 vs Mock)中差异表达基因的分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 陆地棉PLCPs基因家族的鉴定和分析 |
| 4.2 陆地棉PLCPs基因家族响应逆境和黄萎病菌的表达分析 |
| 4.3 PLCPs在植物抗病中的作用 |
| 4.4 超量表达GhRD21-7株系抗黄萎病菌的分子机理 |
| 4.5 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1:表达载体构建 |
| 附录2:质粒的提取 |
| 附录3:PCR产物纯化和酶切产物回收 |
| 附录4:热激转化和电击转化 |
| 附录5:植物基因组DNA提取 |
| 附录6:Southern blotting |
| 附录7:RNA提取 |
| 附录8:PDA、Czapek's配方 |
| 附表 |
| 博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（10）大丽轮枝菌胁迫下棉花次生代谢产物质谱分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 棉花黄萎病及抗黄萎病棉花育种的技术瓶颈 |
| 2 植物次生代谢产物 |
| 2.1 植物次生代谢及其产物特点特性 |
| 2.2 植物次生代谢产物种类 |
| 2.3 次生代谢产物检测与分析方法 |
| 2.4 棉花代谢产物研究状况 |
| 2.5 棉花次生代谢产物与棉花黄萎病关系 |
| 2.6 本论文研究的意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 人工棉花黄萎病病圃建立 |
| 1.1 供试病原菌 |
| 1.2 病原菌一级种子生产 |
| 1.3 病原菌二级种子繁殖和生产种子生产 |
| 1.4 病圃土壤接种与维护 |
| 2 供试棉花材料对黄萎病抗性评价 |
| 3 供试棉花样品准备 |
| 3.1 供试棉花材料选择 |
| 3.2 供试样品制备 |
| 4 棉花次生代谢产物分析 |
| 4.1 供试样品的基本信息及分组 |
| 4.2 供试材料和试剂 |
| 4.3 样品处理 |
| 4.4 LC/MS检测程序 |
| 4.5 数据预处理 |
| 4.6 数据分析内容及组间差异物质筛选 |
| 4.7 次生代谢产物定性 |
| 4.8 多变量统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 供试棉花材料对棉花黄萎病抗性表现 |
| 2 棉苗次生代谢产物质谱数据总体分析 |
| 2.1 棉苗次生代谢产物LC-MS-ESI质谱数据提取及数据集构建 |
| 2.2 原始色谱图的可视化检查 |
| 2.3 所有样本主成分(PCA)分析 |
| 3 自然发育处理中不同品种间棉花次生代谢产物的质谱数据分析 |
| 3.1 自然发育处理中不同品种间棉花根部次生代谢产物分析：B-H组间分析 |
| 3.2 自然发育处理中不同品种间棉花茎部次生代谢产物分析：D-J组间分析 |
| 3.3 自然发育处理中不同品种间棉花叶部次生代谢产物分析：F-L组间分析 |
| 4 病原菌侵染处理中不同品种间棉花次生代谢产物的质谱数据分析 |
| 4.1 病原菌侵染处理中不同品种间棉花根部次生代谢产物分析：A-G组间分析 |
| 4.2 病原菌侵染处理中不同品种间棉花茎部次生代谢产物分析：C-I组间分析 |
| 4.3 病原菌侵染处理中不同品种间棉花叶部次生代谢产物分析：E-K组间分析 |
| 5 不同处理间中亲本棉花91079-80次生代谢产物的质谱数据分析 |
| 5.1 不同处理间亲本棉花91079-80根部次生代谢产物分析：A-B组间分析 |
| 5.2 不同处理间亲本棉花91079-80茎部次生代谢产物分析：C-D组间分析 |
| 5.3 不同处理间亲本棉花91079-80叶部次生代谢产物分析：E-F组间分析 |
| 6 不同处理间转基因棉花90472-4次生代谢产物的质谱数据分析 |
| 6.1 不同处理间转基因棉花90472-4根部次生代谢产物分析：G-H组间分析 |
| 6.2 不同处理间转基因棉花90472-4茎部次生代谢产物分析：I-J组间分析 |
| 6.3 不同处理间转基因棉花90472-4叶部次生代谢产物分析：K-L组间分析 |
| 7 抗、感黄萎病棉花品种间次生代谢产物的分析与挖掘 |
| 7.1 抗、感黄萎病棉花品种间差异次生代谢产物及重要差异次生代谢产物总体情况 |
| 7.2 抗、感黄萎病棉花品种间差异次生代谢产物的分析与挖掘 |
| 8 与大丽轮枝菌侵染相关的病程相关次生代谢产物分析与挖掘 |
| 8.1 不同处理间棉花差异次生代谢产物及重要差异次生代谢产物总体情况 |
| 8.2 病程相关次生代谢产物分析与挖掘 |
| 9 重要差异次生代谢产物及其定性 |
| 第四章 讨论 |
| 1 高通量物质分析技术 |
| 2 次生代谢产物定性 |
| 3 棉花次生代谢产物分析与数据挖掘 |
| 3.1 指纹代谢产物挖掘 |
| 3.2 病程相关代谢产物挖掘 |
| 4 指纹代谢产物与病程相关代谢产物分布及其关系 |
| 4.1 指纹代谢产物分布具有棉花组织特异性 |
| 4.2 病程相关代谢产物分布具有棉花组织特异性 |
| 4.3 指纹代谢产物与病程相关代谢产物关系 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 攻读博士学位期间参加的研究项目 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、棉花抗黄萎病研究取得重大成果（论文参考文献）
- [1]海岛棉GbWRKY1基因抗黄萎病的功能研究[D]. 张雪. 河北大学, 2021(11)
- [2]陆地棉候选感黄萎病基因的克隆及功能研究[D]. 贺浪. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]棉花陆海渐渗系群体的产量品质、抗黄萎病QTL挖掘及qVW-5-1的精细定位[D]. 杨芮. 中国农业科学院, 2021
- [4]海岛棉GST基因家族遗传进化及关键直系同源基因抗黄萎病功能研究[D]. 李扬. 河北农业大学, 2020(01)
- [5]Gh4CL30和GhWRKY70D13在棉花抗黄萎病中的功能研究[D]. 熊显鹏. 石河子大学, 2020(08)
- [6]GhSDH1-1正向调控棉花对黄萎病抗性的机制研究[D]. 张向月. 中国农业科学院, 2020(01)
- [7]陆地棉GhLAC家族鉴定及候选基因抗黄萎病功能研究[D]. 赵晶. 河北农业大学, 2019(03)
- [8]色氨酸代谢与棉花抗黄萎病免疫调控[D]. 苗玉焕. 华中农业大学, 2019(01)
- [9]棉花PLCP基因的全基因组鉴定和GhRD21-7在抗黄萎病反应中的功能解析[D]. 张书芹. 华中农业大学, 2019(01)
- [10]大丽轮枝菌胁迫下棉花次生代谢产物质谱分析[D]. 李社增. 河北农业大学, 2018