（泸州医学院附属医院胸心外科四川泸州646000）
【摘要】目的：通过检测先心病伴肺动脉高压患者血清ET-1、VEGF、eNOS表达，探讨先心病肺动脉高压发生的可能机制。方法：患先天性心脏病患者，经心脏彩超评估PASP，据PASP水平将患者分为正常组（n=12）、轻度PAH组（n=12）、中度PAH组（n=12）、重度PAH组（n=12）。应用ELISA法进行血清ET-1、VEGF、eNOS检测，统计、分析血清ET-1、VEGF、eNOS与肺动脉压改变关系。结果：各组血清ET-1、VEGF、eNOS比较，轻度、中度、重度PAH组各指标均呈逐渐增高，中度、重度PAH组各指标较正常组均增高，血清VEGF轻度PAH组较正常组增高，差异均具有统计学意义。中度、重度PAH组RA、RV较正常组和轻度PAH组增大。结论：先心病伴肺动脉高压患者随着PASP增高，血清ET-1、VEGF、eNOS表达增加，且与PASP存在正相关；ET-1、VEGF、eNOS参与PAH的形成,三者可能存在相互促进作用。
【关键词】先心病；肺动脉高压；ET-1；VEGF；eNOS
【中图分类号】R544.1【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）02-0035-04
ResearchOfET-1,VEGF,eNOSExpressionOfTheCongenitalHeartDiseasePatientsWithPulmonaryArteryHypertension
DengMingbin,FuYong,LiaoBin,YuFengxu,FangYibing,WuChangxue.DepartmentofThoracicandCardiovascularSurgery,theAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege.SichuanProvince,Luzhou646000,China
【Abstract】ObjectiveTodetectserumET-1,VEGF,eNOSexpressionofthepatientswithcongenitalheartdisease(CHD)pulmonaryArteryhypertension(PAH),andexplorethepossiblemechanismofPAH.MethodsPatientswithCHDwereassessedthepulmonaryarterysystolicpressure(PASP)bytheechocardiography.Allpatientswerepidedintonormalgroup(n=12),mildPAHgroup(n=12),moderatePAHgroup(n=12),andseverePAHgroup(n=12)accordingtoPASPlevels.SerumET-1,VEGF,eNOSexpressionweredetectedbyELISA.Statisticalanalysiswasdonetoexploretherelationshipbetweenthemandpulmonaryarterialpressure.ResultsSerumET-1,VEGF,eNOSexpressioninthemild,moderateandseverePAHgroupshowedthattheindexsgraduallyincreased.SerumET-1,VEGF,eNOSexpressioninthemoderateandseverePAHgroupweresignificantlyhigherthanthatinthenormalgroup.SerumVEGFinthemildPAHgroupwashigherthanthatinthenormalgroup.Allthedifferenceswerestatisticallysignificant.ThediametersOfrightatriumandrightventriculeinthemoderateandseverePAHgroupwerelargerthanthatinthenormalgroupandmildPAHgroup.ConclusionsThePASPofpatientswithCHDPAHwereincreased,serumET-1,VEGF,eNOSexpressionwereincreased,thePASPwaspositivelycorrelatedwiththeserumET-1,VEGFandeNOSexpession.theET-1,VEGFandeNOSwereinvolvedintheformationofPAH,threeindexsmaybereinforcemutually.
【Keywords】CongenitalHeartDisease;PulmonaryArteryHypertension;ET-1;VEGF;eNOS
先天性心脏病(congenitalheartdisease,CHD)伴肺动脉高压(pulmonaryarteryhypertension,PAH)形成是心血管外科领域最常见的严重并发症之一，患者虽行手术矫治，但术后易发生肺动脉高压危象，死亡风险大。本文通过血清内皮素-1（endothelin-1,ET-1）、血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）、内皮细胞型一氧化氮合酶（endothelialnitricoxidesynthase，eNOS）表达检测，探讨肺动脉高压形成的可能机制。
1.资料与方法
1.1一般资料
我院2011年10月～2013年3月收治的先天性患者48例，男23例，女25例，年龄6～35岁，所有患者均于术前行体格检查、心电图、胸片及经胸超声心动图等检查。根据超声测量患者肺动脉收缩压（pulmonaryarterysystolicpressure,PASP）水平将患者分为正常组（n=12）、轻度PAH组（n=12）、中度PAH组（n=12）、重度PAH组（n=12）。
1.2仪器、试剂
StockertSⅢ型体外循环机（德国），GEVivid7D彩色多普勒超声诊断仪（美国），SH138-iSTAT血气分析仪（美国），150C型离心机（北京白洋医疗器械有限公司）、真空采血管（金典生化器材有限公司，山东），塑料离心管（盛邦实验器材有限公司，江苏），eppendorf微量可调移液器（德国）、phomo酶标仪（奥地利）、内皮素-1酶联免疫分析试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）、血管内皮生长因子酶联免疫分析试剂盒（上海酶联生物科技有限公司），内皮细胞型一氧化氮合酶酶联免疫分析试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）。
1.3检查方法
1.3.1超声检查方法
取胸前、剑下、胸骨上窝常规切面，观察测量心脏畸形，用脉冲及连续多普勒，调整好声束与感兴趣血流束的夹角，使两者尽可能平行，使血流与频谱轮廓尽可能清晰，测其峰值流速，包括三尖瓣返流流速，PASP=4V2+10mmHg(右房增大者为15mmHg)，V为三尖瓣返流的峰值流速，对肺动脉高压者规定轻、中、重度测值分别为：30～50mmHg，50～70mmHg，＞70mmHg，≤30mmHg为无肺动脉高压[1-3]。
1.3.2ET-1检测方法
采集静脉血，标本于室温放置2-4小时，后以3000r/min离心20分钟，取上清液于EP管中置于-20°保存备用。
采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测患者血清ET-1、VEGF、eNOS，按照ET-1、VEGF、eNOS酶联免疫分析试剂盒操作说明书进行操作。试验结果判定以酶标仪读数为准。据标准品检测结果，计算准品浓度曲线。ET-1标准品浓度曲线：Y=345.83X-19.973，相关系数：R=0.995；VEGF标准品浓度曲线：Y=1808.3X-14.541，相关系数：R=0.995；eNOS标准品浓度曲线：Y=54.65X+0.016，相关系数：R=0.994。
1.4统计学方法
采用SPSS17.0统计软件包进行分析。计量资料采用x-±s表示，组间比较采用采用单因素方差分析，变量间相关性采用Pearson相关分析法，P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1各组患者组一般资料的比较
经心脏彩超评估患者LA、LVDd、LVDs、RA、RV、PASP心脏指标，各组一般资料比较，如表1。
2.3各组患者ET-1、VEGF、eNOS、PASP直线回归分析
直线相关性分析：ET-1、VEGF、eNOS与PASP（r分别为0.898、0.826、0.877，P＜0.05）；VEGF、eNOS与ET-1（r分别为0.929、0.923，P＜0.05）；VEGF与eNOS（r为0.855，P＜0.05）。
直线回归分析：针对各指标将PASP作为应变量y，以ET-1、VEGF、eNOS分别作为自变量x，进行直线回归分析，直线回归方程分别为：y=4.2x+17.611、y=0.393x-4.872、y=8.132x-2.122；针对各指标将ET-1作为应变量y，以VEGF、eNOS分别作为自变量x，进行直线回归分析，直线回归方程分别为：y=0.095x-5.491、y=1.83x-3.987；针对指标将VEGF作为应变量y，以eNOS分别作为自变量x，进行直线回归分析，直线回归方程分别为：y=0.044x+0.305。
3.讨论
先心病心脏及大血管异常解剖结构，常导致血流动力学改变，形成左向右的血液分流，右心系统形成高血流量，右心系统超负荷，造成右心结构重构，形成右心房和右心室结构在中重度PAH组较正常组和轻度PAH增大。异常血流动力学改变引起肺血管收缩反应增强和肺血管结构重建，这是形成先心病肺动脉高压的常见原因[4]。然而其确切发生机制至今尚未完全阐明[5]。
肺血流动力学改变对肺动高压形成产生影响，血管内皮细胞在血流切应力作用下发生的病理生理的改变是目前研究PAH的方向[6]。ET-1、VEGF及eNOS都是内皮细胞合成的血管活性物质，均对肺血管有明显的调节作用，通过旁分泌、自分泌等多种方式参与肺血管的病理生理过程。
ET-1是由内皮细胞合成的一种含21个氨基酸的多肽[7]，是目前已知作用最强、持续时间最久的缩血管活性肽[8]，ET-1收缩血管的作用与血管内皮细胞ETA和血管平滑肌上特异性ETA、ETB受体结合有关，通过磷酸肌醇途径介导的钙依赖性过程，胞内Ca2+动员，胞外Ca2+内流和Na+/Ca2+交换等钙信号机制的参与，膜去极化也可激活Ca2+通道，使胞外Ca2+跨膜内流，细胞内钙超载引起肺血管平滑肌强烈收缩有关[9、10]。通过对正常组、轻度、中度及重度PAH组患者血清ET-1检测，结果表明正常组和轻度组无明显差异，而中度及重度组患者ET-1明显增高，且重度组ET-1增高最明显。这可能与PAH早期患者肺血流切应力作用于血管内皮，引起内皮细胞分泌ET-1增加[11、12]，但这种改变还不足以引起大量的ET-1释放，对肺血管收缩作用还不明显。在中、重度PAH患者肺血管在高血流压力及切应力作用下对血管内皮刺激明显增加，导致ET-1分泌增加，引起肺血管强烈收缩，肺循环阻力增高，肺动脉压力进一步增高，造成血流切应力增加，形成恶性循环，最终造成PAH进行性加重；在本实验中ET-1表达与PASP存在正相关结果，随着PASP的增高ET-1表达增加，可能与ET-1表达和PASP相互促进有关。研究表明ET-1不仅是一种强烈的缩血管因子，也是一种的平滑肌细胞分裂剂，可成倍的提高血管平滑肌细胞的增殖速度[13]，促进成纤维细胞增生，表明ET-1也参与肺血管的重构，加速肺血管狭窄的进程和肺血管阻力增加的发生。
VEGF是血小板衍生生长因子家庭成员之一，与其特异性受体FLK-1结合，具有促进内皮细胞增殖和诱导血管平滑肌迁延等作用，还可增加血管的通透性，促进内皮细胞间质的胶原酶的表达，促进血清纤维蛋白原的外渗，导致纤维蛋白原的沉积[14]；VEGF不仅参与维持内皮细胞自身结构和功能的稳定，还能促进内皮细胞增殖和抗内皮细胞凋亡，同时能使内皮细胞产NO,通过VEGF/NO信号系统参与血管的生长和空间结构形成的调节[15]，对肺血管重构起重要作用。通过本实验检测各组患者血清VEGF表达，各组比较呈现进行性增高的趋势，可能与PAH早期即存在左向右的大量血液分流，导致右心排出量增加，肺血管被动性扩张，发生反应性收缩，引起局部缺血，使肺动脉压力进行性升高，出现弹性蛋白酶活性增加，促使平滑肌细胞肥厚和结缔组织蛋白合成增加，从而导致肺血管重构及肺动脉压力升高；本实验中VEGF表达与PASP存在正相关，可能与肺血流剪切力作用下血管内皮细胞受损有关，受损的血管内皮细胞合成与代谢的多种血管活性物质包括VEGF水平均发生变化，这种活性物质表达的改变与PASP和内皮损伤程度相关，最终导致肺动脉压力进一步升高及肺血管不可逆病变发生有关[16]。
一氧化氮合酶（nitricoxidesynthase，NOS）是还原型辅酶Ⅱ(DADPH)依赖性的氧化酶。在体内NOS在DADPH和氧作用下催化左旋精氨酸(L-Arg)生成NO和左旋胍氨酸[17]。NOS作为NO的限速酶，在体内广泛分布，其中血管内皮细胞是最为集中的部位。NOS主要有三种不同的亚型：神经型NOS(nNOS)、诱导型NOS(iNOS)及内皮细胞型(eNOS)。其中eNOS和nNOS为钙依赖性，其活性受钙离子及钙调蛋白浓度的调节，主要在正常组织中表达，持续时间短，催化生成NO发挥生理作用[18]。通过实验检测血清eNOS表达，表明中重度PAH患者eNOS表达较正常组和轻度PAH组明显升高，尤其在重度PAH患者升高最为明显。在PAH早期患者肺血流增加，引起内皮细胞分泌eNOS增加，使生成NO增加，但这种增加较正常组无明显的改变，可能与PAH早期除了存在肺血管活性物质的自分泌和旁分泌以外，机体自身的神经体液对肺血管的调节有关；本实验中eNOS与PASP存在正相关，在eNOS表达分析中，我们发现eNOS呈进行性增加，尤其在中、重度PAH时eNOS表达增加更为明显，可能与中、重度PAH时患者通过其他途径的代偿不能很好的舒张血管减轻肺动脉压力，导致内皮细胞分泌eNOS明显增加，对PAH起保护作用[19]，产生NO来缓解血管的收缩或狭窄所带来的阻力增加有关。
通过血清ET-1、VEGF与eNOS三者表达的相关性分析，三者均存在正相关。说明ET-1、VEGF与eNOS之间可能存在某种联系或相互影响关系。正常情况下肺血管内皮细胞分泌一定量的ET-1、VEGF与eNOS以维持肺血管的正常收缩和舒张功能。在左向右分流的先心病患者，其肺血流动力学发生改变，其机制可能为随着血流动力学改变，血流切应力增加，肺血管内皮细胞分泌ET-1增加，Ca2+内流，这不仅使血管收缩，还使肺动脉压力及肺血管阻力升高；为了减轻ET-1缩血管的作用及Ca2+的改变影响，内皮细胞增加eNOS的分泌，促进NO的合成增加，以减轻ET-1的缩血管作用，随着PASP的进展，ET-1与eNOS的分泌进行性增加；与此同时VEGF与其受体结合后，通过细胞内钙调蛋白及磷酸肌醇途径使eNOS的表达增加[20]，使内皮细胞释放NO增加，NO又促使内皮细胞由静止型向运动表型转化，使内皮细胞定向移动，导致细胞迁移及新生血管的形成。故ET-1、VEGF与eNOS三者参与PAH的形成，在钙离子、钙调节蛋白和磷酸肌醇途径作用下，存在相互促进作用。
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