李文英（浙江大学医学院附属妇产科医院新生儿科浙江杭州３１０００６）
【中图分类号】Ｒ９６５【文献标识码】Ａ【文章编号】１６７２－３７８３（２０１５）０７－０６３８－０１【摘要】目的探讨川芎嗪对新生鼠窒息后脑组织内Ｐ５３蛋白表达的影响。方法将６０只７日龄新生ＳＤ大鼠随机分为对照组、窒息组和治疗组（各２０只）。窒息组常压窒息，治疗组在窒息前和窒息后即刻各腹腔注射川芎嗪（４０ｍｇ／ｋｇ）一次，而对照组和窒息组均注射同体积生理盐水。各组于造模后以ＴＵＮＥＬ法和ＳＰ法分别检测海马区神经元凋亡数与Ｐ５３阳性细胞数量变化。结果对照组海马区几乎无Ｐ５３阳性细胞及凋亡神经元，窒息组及治疗组海马区Ｐ５３阳性细胞及神经元凋亡数量均显著高于对照组（Ｐ＜０．０５），而治疗组海马区神经元凋亡和Ｐ５３阳性细胞数量均较窒组息减少（Ｐ＜０．０５）。结论川芎嗪可能通过抑制窒息新生大鼠脑组织Ｐ５３的表达而减少神经细胞的凋亡，从而对窒息脑损伤起到保护作用。
【关键词】川芎嗪；窒息；新生大鼠；凋亡；Ｐ５３
围生期窒息常导致新生儿缺氧缺血性脑病（ｈｙｐｏｘｉｃ．ｉｓｃｈｅｍｉｃｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ，ＨＩＥ）的发生，研究表明凋亡为ＨＩＥ中神经元死亡的主要形式［１］。Ｐ５３蛋白是细胞凋亡的调控因子，通过调节相关凋亡因子的表达而诱导细胞凋亡的发生［２］。既往研究证实川芎嗪具有抗调亡及脑保护作用［３．６］，但川芎嗪是否可以通过抑制Ｐ５３的表达而抑制窒息诱导的神经细胞调往未见报道。
１材料和方法１．１实验药品与仪器鼠抗人Ｐ５３单克隆抗体（美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司），ＳＰ免疫组化试剂盒（中杉公司）等。
１．２实验动物与分组新生７日龄ＳＤ大鼠６０只随机分为对照组、窒息组和治疗组各２０只，各组再分为１２ｈ、１、３、７天组，每组各５只。
１．３动物模型制备采用新生鼠常压窒息模型［７］，在容积为５５ｍＬ的磨口瓶中分别装入０．００５ｋｇ钠石灰，然后将新生大鼠分别置于磨口瓶中，待动物安静后，用凡士林涂抹瓶口，塞紧瓶塞，开始密闭３０ｍｉｎ后打开瓶塞复氧。对照组模拟此过程不塞瓶塞（不做缺氧处理）。治疗组在窒息前和窒息后每日腹腔注射川芎嗪（４０ｍｇ／ｋｇ）［６］，而对照组和窒息组均在相同时间点注射同体积生理盐水。
１．４取材与切片三组新生大鼠分别于窒息后不同时间点（１２ｈ、１、３、７ｄ）断头处死，脑组织于４％多聚甲醛中固定，酒精脱水'氯仿透明'石蜡包埋，经海马区连续切片（片厚５ｕｍ），分别用于细胞凋亡检测及Ｐ５３免疫细胞化学反应。
１．５ＴＵＮＥＬ染色检测细胞凋亡及ＳＰ法检测Ｐ５３蛋白表达按试剂盒说明操作，每张标本随机选取海马区各５个高倍视野（４００倍），计数每个视野中阳性细胞数，取其平均值作为该切片的阳性细胞数。
１．６统计学分析采用ｓｐｓｓ１３．０软件进行统计学处理，数据以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，同一指标多组均数间比较采用单因素方差分析，两两比较采用ＬＳＤ检验。Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
２结果２．１窒息后不同时间点的ＴＵＮＥＬ染色结果ＴＵＮＥＬ染色阳性细胞为细胞核染为棕褐色。对照组海马区偶见阳性细胞，对照组各时间点无明显差异（Ｐ＞０．０５）［窒息组各时间点海马区每高倍镜视野阳性细胞数分别为７．２０±１．４８、１２．５０±２．１２、８．５３±１．９５、５．０２±１．１３，较对照组显著增加（Ｐ＜０．０５），［川芎嗪治疗组海马区阳性细胞数均较窒息组显著减少（Ｐ＜０．０５）。
２．２Ｐ５３的免疫组化染色结果Ｐ５３阳性细胞的细胞核染为棕褐色。对照组大鼠海马区几乎无Ｐ５３阳性细胞表达；窒息组大鼠脑组织海马区Ｐ５３阳性细胞数量在各时间点均较对照组明显增加，其各时间点海马区每高倍镜视野Ｐ５３阳性细胞数量分别为１０．６３±１．５４、８．０２±０．７８、７．３３±０．９８、７．１２±１．２１；川芎嗪治疗组各对应时间点海马区每高倍镜视野Ｐ５３阳性细胞数分别为５．４１±１．２１、６．８８±１．５３、５．３９±１．４０、２．６９±０．９８，组间比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）（图２）。
３讨论围生期窒息所致ＨＩＥ是引起新生儿死亡和神经系统发育障碍的重要原因之一。目前对于ＨＩＥ发病机制的研究认为该病涉及多种因素参与［１］。近年来，随着对细胞凋亡机制的深入研究，神经细胞凋亡在ＨＩＥ发病过程中所起的作用越来越受到关注。新生鼠缺氧缺血性脑损伤后，大脑皮质和海马区均可见大量神经元出现凋亡［８］。本实验发现窒息新生鼠海马区凋亡细胞数量明显较对照组增加，这也证实了窒息因素确能导致神经细胞凋亡。研究表明窒息所致神经元凋亡与促凋亡因子的释放相关［９］。Ｐ５３蛋白是由Ｐ５３基因编码的一种肿瘤抑制蛋白，该蛋白定位于细胞核中，在各组织中广泛表达，但表达水平较低。当细胞面临缺氧、缺血等各种外来损伤时，Ｐ５３基因即可对编码细胞周期相关蛋白的基因表达造成影响，从而导致细胞分裂停滞于Ｇ１期；同时，Ｐ５３蛋白表达增强还能导致促凋亡基因Ｂａｘ等的表达增加，以致细胞凋亡发生［９］，因此，Ｐ５３基因及Ｐ５３蛋白对细胞凋亡的作用已受到广泛关注。王娟等实验也证实新生鼠缺氧缺血性脑损伤后，脑内Ｐ５３蛋白表达增加［１０］。我们实验表明窒息可促进新生鼠脑组织内Ｐ５３蛋白的表达增加；同时发现窒息组在Ｐ５３蛋白表达增加的同时，海马区神经细胞凋亡也随之增加，提示窒息后脑组织内神经细胞凋亡的发生可能与Ｐ５３蛋白表达增加有关。
川芎嗪是从中药川芎的有效成分，能穿过血脑屏障而到达脑组织内部各部位从而对缺氧损伤神经细胞具有保护作用［１１］，因此，目前该药被广泛用于缺氧缺血性脑血管疾病的治疗。王勇等发现川芎嗪干预后，体外培养的缺氧复氧胎鼠海马神经细胞活力增加，细胞凋亡率下降。任灵等［３］实验也表明川芎嗪可抑制脑缺血再灌注所致神经元凋亡。本实验发现，与窒息组比较，川芎嗪治疗组细胞凋亡率下降，同时细胞内Ｐ５３蛋白表达水平明显下降，这提示川芎嗪可能通过抑制Ｐ５３蛋白表达而减轻窒息所致神经元凋亡。
综上所述，本实验证实川芎嗪对窒息脑损伤具有保护作用，其机制可能与抑制Ｐ５３蛋白的表达从而减少神经细胞凋亡有关，对其应用于临床治疗新生儿窒息脑损伤提供了一定的实验依据。
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