磺化壳聚糖对细菌及其生物被膜抑制作用的研究

论文摘要

在自然界中,附着在有生命或无生命物体表面,被细胞外基质所包裹的三维细菌群落的生物被膜是细菌最主要的生存状态,能广泛引起慢性和复发性传染病。而且,生物被膜内的细菌具有较浮游细菌强1000倍的抗药性。生物被膜一旦形成,一般的抗生素、消毒剂很难将其去除,在医疗和食品安全等领域带来很大的风险。因此,研发天然的、安全的抗生物被膜制剂具有重要的意义。自然界仅次于纤维素的第二大天然有机化合物,壳聚糖,是甲壳素的N-脱乙酰基衍生物。其不仅具有抗菌特性,还具有无毒、生物可降解和生物相容性等特点。但是,壳聚糖的溶解性在很大程度上限制了其广泛应用。本论文对壳聚糖进行分子修饰,通过亲核取代反应在壳聚糖的2-NH2引入磺酸基,旨在改善其溶解性,提高其抑菌性能,并深入研究其对铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）、大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（S.aureus）的生物被膜抑制性能。具体研究内容和结果如下:（1）制备得到水溶性的磺化壳聚糖,利用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、核磁共振光谱（NMR）、凝胶渗透色谱（GPC）、元素分析（EA）和热重分析（TGA）等进行各项表征。（2）以 P.aeruginosa,E.coli 和 S.aureus 为供试菌,测定水溶性壳聚糖（WCS）和磺化壳聚糖（SCS）对细菌的抑制性能。结果显示:WCS和SCS对三种供试菌的最小抑菌浓度（MIC）均分别为1、1和2 mg/mL。WCS对三种供试菌的最小杀菌浓度（MBC）分别为16、8和32mg/mL,而SCS对三种供试菌的MBC分别为8、4和16 mg/mL。可见SCS相比WCS具有较好的杀菌性能。从WCS和SCS作用于P.aeruginosa、E.coli 和 S.aureus 的 time-kill 曲线得到,MIC浓度的WCS和SCS均可以明显抑制这三种供试菌的生长。当样品的浓度达到2MIC和4MIC时,WCS和SCS起到杀菌作用。（3）分析了不同时间对P.aeruginosa,E.coli 和 S.aureus的生物被膜形成的影响。结果发现,培养时间为2d时,三种供试菌的成膜量均达到最高。WCS和SCS对培养2 d的P.aeruginosa,E coli和S.aureus的生物被膜的抑制实验得到:经WCS和SCS处理后,三种供试菌的生物被膜的活菌数、胞外多糖的分泌量和代谢活性均显著降低。其中,SCS对细菌生物被膜的抑制能力比WCS更强,且同浓度大小有关。利用激光共聚焦显微镜（CLSM）观察生物被膜,可以清楚的发现对照组分布着厚实且均匀的绿色团簇,有多层活细胞,表明盖玻片表面有大量的生物被膜形成。而经1/2MIC和MIC浓度的WCS和SCS处理的CLSM图片可以看出:绿色荧光强度显著降低,红棕色荧光强度增加,生物被膜的结构明显被破坏。进一步从扫描电镜（SEM）观察得到:与对照组相比,经1/2MIC浓度的WCS和SCS处理的细菌生物被膜被严重破坏,胞外分泌物大量减少,被膜菌的形态出现凹陷、扭曲和破裂,失去了完整的细胞形态。实验结果说明,WCS和SCS具有较好的抑制这三种供试菌生物被膜形成的性能,而SCS相比WCS,其抑菌性和抑制生物被膜形成能力更强。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
•   1.1 细菌生物被膜
•     1.1.1 生物被膜的简介
•     1.1.2 生物被膜形成机制
•     1.1.3 生物被膜对食品工业的危害
•     1.1.4 生物被膜的控制
•       1.1.4.1 清洗和消毒
•       1.1.4.2 采用群体感应的抑制剂
•       1.1.4.3 采用酶、噬菌体的生物学控制
•   1.2 壳聚糖概述
•     1.2.1 壳聚糖简介
•     1.2.2 壳聚糖的化学改性
•       1.2.2.1 羧基化反应
•       1.2.2.2 季铵化反应
•       1.2.2.3 酰基化反应
•       1.2.2.4 烷基化反应
•       1.2.2.5 磺化反应
•     1.2.3 壳聚糖及其衍生物的抑菌性
•     1.2.4 壳聚糖及其衍生物的抑菌机理
•     1.2.5 壳聚糖及其衍生物对细菌生物被膜的控制
•   1.3 本研究的选题意义和研究内容
•     1.3.1 选题意义
•     1.3.2 本研究的主要内容
• 第2章 磺化壳聚糖的制备、表征及其抑菌性能的研究
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料与仪器
•     2.2.1 实验材料与试剂
•     2.2.2 实验仪器与设备
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 磺化壳聚糖的制备
•     2.3.2 磺化壳聚糖的表征
•       2.3.2.1 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）测定
•       2.3.2.2 核磁共振光谱（NMR）测定
•       2.3.2.3 凝胶渗透色谱（GPC）测定
•       2.3.2.4 元素分析（EA）
•       2.3.2.5 热重分析（TGA）
•     2.3.3 抑菌实验
•       2.3.3.1 菌株的活化
•       2.3.3.2 最小抑菌浓度的测定
•       2.3.3.3 最小杀菌浓度的测定
•       2.3.3.4 壳聚糖及其衍生物抑菌与时间的关系
•     2.3.4 数据分析
•   2.4 结果与分析
•     2.4.1 磺化壳聚糖的表征
•     2.4.2 抑菌结果
•       2.4.2.1 MIC和MBC结果
•       2.4.2.2 壳聚糖及其衍生物抑菌的time-kill曲线
•   2.5 本章小结
• 第3章 壳聚糖及其衍生物对生物被膜的抑制作用
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料与仪器
•     3.2.1 实验材料与试剂
•     3.2.2 实验仪器与设备
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 菌株的活化
•     3.3.2 不同培养时间对生物被膜形成的影响
•     3.3.3 被膜菌的粘附实验
•     3.3.4 胞外多糖（EPS）含量测定
•     3.3.5 被膜菌代谢活性的测定
•     3.3.6 激光共聚焦显微镜（CLSM）观察生物被膜
•     3.3.7 扫描电镜（SEM）观察生物被膜
•   3.4 数据分析
•   3.5 结果与分析
•     3.5.1 不同培养时间对生物被膜形成的影响
•     3.5.2 壳聚糖及其衍生物对被膜菌粘附的影响
•     3.5.3 壳聚糖及其衍生物对生物被膜胞外多糖的影响
•     3.5.4 壳聚糖及其衍生物对被膜菌代谢活性的影响
•     3.5.5 激光共聚焦显微镜观察壳聚糖及其衍生物对生物被膜的抑制
•     3.5.6 扫描电镜观察壳聚糖及其衍生物对被膜菌形态的影响
•   3.6 本章小结
• 第4章 结论与展望
•   4.1 总结
•   4.2 创新与展望
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 研究生阶段发表的论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘玉红

导师: 黄建颖

关键词: 壳聚糖衍生物,抑菌性能,抑制生物被膜,激光共聚焦显微镜,扫描电镜

来源: 浙江工商大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 浙江工商大学

分类号: TS201.3

总页数: 71

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