荧光假单胞菌中TetR家族转录因子PhIH的结构与功能研究

论文摘要

荧光假单胞菌（Pseudommonas fluorescens）是革兰氏阴性细菌,是典型的有益植物的共生细菌。它能够生产出许多次级代谢产物,如2,4-二乙酰基间苯三酚（2,4-diacetylphloroglucinol,2,4-DAPG）,氰化氢和铁载体,增强了荧光假单胞菌与其他土壤微生物的竞争优势。其中,抗生素2,4-DAPG被证明是荧光假单胞菌抑制植物病害的关键性因素。2,4-DAPG是一种小分子化合物,是许多荧光假单胞菌的生物防治来源,其合成相关的基因簇phl包含八个基因,被命名为phlACBDEFGH,其中TetR家族转录调节因子（TetR family transcriptional regulator,TFR）PhlH最近己显示具有2,4-DAPG生物合成的负反馈调节作用。phlG基因编码C-C键水解酶,能特异性地将2,4-DAPG降解为低毒性的单乙酰基间苯三酚（monoacetylphloroglucinol,MAPG）。PhlH可以通过检测2,4-DAPG的浓度来调节phIG基因的表达,动态释放2,4-DAPG的潜在代谢负担,它为荧光假单胞菌提供了选择优势,在竞争激烈的根际中具有生物控制功能。通过序列比对我们发现PhlH较其他蛋白序列同源性很低,结构未知。本研究通过X射线衍射得到了分辨率为2.4A的apo-PhlH晶体结构。分析apo-PhlH结构,我们可以看出整个蛋白结构处于不稳定的状态,特别是负责变构的区域。其中两个loop中有部分氨基酸残基是缺失的,α6和α7之间的loop以及α8和α9之间的loop,推测缺失的原因由于该区域处于灵活的状态导致没有捕捉到电子密度,从而使部分氨基酸残基没有完全的搭建出来。除此之外还得到了分辨率为2.1A的PhlH-2,4-DAPG复合物的晶体结构,PhlH-2,4-DAPG结构处于一种低能量的稳定状态。通过对apo-PhlH和PhlH-2,4-DAPG结构的DNA结构域（DNA-binding domain,DBD）对比分析,我们发现PhlH-2,4-DAPG结构相比apo-PhlH结构整个DBD产生很大的位移,由原本apo-PhlH结构中两个α3之间34A的距离,增大了 12A变成了46A形成了不容易与DNA大沟结合的距离。EMSA和ITC实验揭示了特定氨基酸残基与配体或者DNA结合的能力变化,其中F173、L85、L186、V190、T123、L177和E132这7个氨基酸对2,4-DAPG的结合是关键的,而H76和K144形成氢键控制2,4-DAPG的进入,起到了门控的作用。这些结果都为TFRs可能的存在状态提供了证据,有助于理解由配体结合诱导的分子基础和构象改变的操纵子激活。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
•   1.1 荧光假单胞菌概述
•   1.2 TetR家族转录因子
•     1.2.1 TFRs的分类
•     1.2.2 TFRs的结构
•   1.3 本研究拟解决的关键科学问题
• 第二章 实验材料
•   2.1 实验试剂与实验仪器
•   2.2 实验试剂配制
• 第三章 实验方法
•   3.1 基因克隆与质粒构建
•     3.1.1 目的基因的克隆
•     3.1.2 DpnI酶切
•     3.1.3 感受态细胞的制备
•     3.1.4 酶切产物的转化
•     3.1.5 阳性克隆鉴定
•   3.2 重组蛋白的表达与纯化
•     3.2.1 重组蛋白的表达
•     3.2.2 重组蛋白的纯化
•   3.3 蛋白晶体的生长和晶体结构数据的收集、处理及解析
•     3.3.1 PhlH蛋白的晶体生长
•     3.3.2 PhlH蛋白复合物的晶体生长
•     3.3.3 PhlH蛋白晶体和PhlH-2,4-DAPG晶体结构数据的收集、处理及解析
•   3.4 凝胶阻滞实验（EMSA）
•   3.5 等温滴定量热法（ITC）实验
•   3.6 蛋白分子量标定
• 第四章 实验结果与讨论
•   4.1 PhlH蛋白的表达纯化
•   4.2 PhlH和PhlH复合物晶体初筛及优化及数据收集
•   4.3 PhlH蛋白晶体和PhlH-2,4-DAPG晶体数据的处理及结构解析
•   4.4 apo-PhlH结构
•   4.5 PhlH-2,4-DAPG复合物结构和PhlH的定点突变实验
•   4.6 PhlH突变体蛋白的表达纯化
•   4.7 PhlH的EMSA实验
•   4.8 PhlH的ITC实验
• 第五章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 吴谨

导师: 葛宏华

关键词: 荧光假单胞菌

来源: 安徽大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 安徽大学

分类号: Q933

总页数: 66

文件大小: 6606K

下载量: 52