含心脏阿霉素反应蛋白基因的重组慢病毒过表达和RNA干扰载体的构建及鉴定

论文摘要

目的:构建心脏阿霉素反应蛋白（CARP）基因重组慢病毒过表达和RNA干扰载体并进一步包装慢病毒,为研究CARP在阿霉素（ADR）心肌病中的作用及机制奠定基础。方法:将PCR扩增的大鼠CARP基因序列和设计合成的短发夹RNA （shRNA）序列分别插入GV-358和GV-248表达载体,行DNA测序鉴定。采用重组CARP过表达和shRNA表达穿梭载体与Helper 1.0和Helper 2.0辅助包装质粒共转染人胚肾细胞HEK293T,进行病毒包装和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度。采用重组慢病毒感染HEK293T细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度。采用重组慢病毒感染H9C2细胞,分为对照组、Scramble RNA组、CARP过表达组和shRNA CARP组,Western blotting法检测各组细胞中CARP蛋白表达水平。结果:基因测序,CARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符。载体转染HEK293T细胞后,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达。包装的CARP过表达及shRNA病毒感染H9C2细胞后,与对照组比较,CARP过表达组细胞中CARP蛋白表达水平升高5.3倍（P=0.01）,shRNA CARP组细胞中CARP蛋白表达水平降低53%（P=0.02）。结论:成功构建了CARP过表达和特异性shRNA慢病毒表达载体并获得高感染效率的过表达和RNA干扰慢病毒,后者在H9C2细胞中能够干预CARP表达。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1．1细胞、主要试剂和仪器
•   1．2细胞培养
•   1．3过表达载体CARP-GV358构建和鉴定
•   1．4携带CARP特异干扰序列慢病毒穿梭质粒的构建和鉴定
•   1．5重组慢病毒的包装、浓缩和滴度测定
•   1．6重组慢病毒感染H9C2细胞和CARP蛋白表达水平检测
•   1．7统计学分析
• 2 结果
•   2．1 CARP-GV358载体的鉴定
•   2．2 CARP-GV358质粒表达的检测
•   2．3 shCARP-GV248载体的鉴定
•   2．4病毒滴度测定
•   2．5 CARP过表达和RNAi慢病毒感染H9C2细胞表达的鉴定
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 梁春梅,许旭三,余华军,周霞,温霞,李友,KOJIC Snezana,汪亚君,马国达

关键词: 心脏阿霉素反应蛋白,干扰,慢病毒,细胞

来源: 吉林大学学报(医学版) 2019年04期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,基础科学

专业: 生物学,心血管系统疾病

单位: 广东医科大学附属医院广东省衰老相关心脑疾病重点实验室,广东医科大学实验动物中心,塞尔维亚贝尔格莱德大学分子遗传学及遗传工程研究所,广东医科大学附属医院临床医学研究中心,黑龙江八一农垦大学生命科学与技术学院

基金: 国家自然科学基金资助课题(81670252,81770034,81571157),黑龙江省教育厅基金资助课题(12521379),广东省科技厅自然科学基金资助课题(2015A030313523),中国-塞尔维亚科技合作委员会第3届例会项目资助课题(3-13),2016年度中共广东省委组织部与广东省人力资源与社会保障厅“扬帆计划”培养高层次人才项目资助课题(4YF17006G)

分类号: Q78;R542.2

DOI: 10.13481/j.1671-587x.20190404

页码: 766-771+982

总页数: 7

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