DNA组装效率的无偏差快速检验——基于qPCR而不依赖于转化的方法

论文摘要

合成生物学正朝着大规模、复杂化的方向发展,这在很大程度上依赖于基因模块的高效组装。传统评估DNA组装效率(AE)的方法需要进行转化,整个过程耗时长达10 h,而且容易受到各种因素的干扰。为快速、可靠地测定组装效率,本研究建立了一种基于q PCR的不依赖于转化的测定方法,用连接上的片段占初始加入片段的比例表征组装效率,3 h即可完成测定。利用该方法测定了酶切连接、Golden Gate组装以及Gibson组装法的双片段或多片段组装效率,所得结果与菌落计数法表征的组装效率呈显著正相关。该方法消除了转化过程的随机性,降低了测定偏差,优于传统的菌落计数法。随后,用此方法研究了DNA片段末端的二级结构对组装效率的影响。结果显示,所有依赖于末端序列互补的组装技术,其组装效率主要受重叠序列整体性质的影响,而发夹结构可显著降低组装效率。这种基于qPCR的测定方法将促进DNA组装技术的发展,并有助于对组装效率影响因素的评估。

论文目录

• 1. 引言
• 2. 材料与方法
•   2.1. 酶切连接
•   2.2. Golden Gate组装
•   2.3. Gibson组装
•   2.4. 转化
•   2.5. 定量PCR
•   2.6. 数据分析
• 3. 实验结果
•   3.1. 不同方法测定的酶切连接效率
•   3.2. 不同方法测定的Golden Gate组装效率
•   3.3. 不同方法测定的Gibson组装效率
•   3.4. 重叠区域二级结构对Gibson组装效率的影响
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 1.Introduction
• 2.Materials and methods
•   2.1.Restriction ligation
•   2.2.Golden Gate assembly
•   2.3.Gibson assembly
•   2.4.Transformation
•   2.5.qPCR
•   2.6.Data analysis
• 3.Results
•   3.1.Efficiencies of restriction ligation generated by different measurements
•   3.2.Efficiencies of Golden Gate assembly generated by different measurements
•   3.3.Efficiencies of Gibson assembly derived from different measurements
•   3.4.Influence of secondary structures in the overlap region on Gibson assembly
• 4.Discussion
• 5.Conclusions

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 马晓焉,梁昕鑫,霍毅欣

关键词: 组装效率,组装,二级结构,转化

来源: Engineering 2019年04期

年度: 2019

分类: 工程科技Ⅱ辑,基础科学

专业: 生物学

单位: Key Laboratory of Molecular Medicine and Biotherapy, School of Life Science, Beijing Institute of Technology,UCLA Institute for Technology Advancement (Suzhou)

基金: 国家重点研发计划(2017YFD0201400）,国家自然科学基金（21676026）,中央高校基本科研业务费的支持~~

分类号: Q523

页码: 447-462

总页数: 16

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