猪HEV衣壳蛋白单克隆抗体结合抗原表位的鉴定及其抗病毒感染机制研究

论文摘要

戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）是感染人类后引起肝脏疾病的一种人畜共患性病毒,在自然界中具有广泛的宿主来源。猪被认为是HEV的重要贮存宿主,主要包括基因3和4型,与人HEV的同源性可达80%-90%。猪HEV可以通过食源性或水源性途径传播给人类,因此阻断猪HEV传播具有重要的公共卫生意义。HEV ORF2编码病毒衣壳蛋白,不仅保证病毒基因组的完整性,还参与病毒多项重要生理活动;HEV ORF2上具有主要的抗原表位区,是关键的疫苗研发靶区。实验室前期原核表达的猪HEV ORF2截短蛋白（sORF2-C,aa 393-660）,经验证具有良好的抗原性和免疫原性。将其免疫小鼠后经杂交瘤制备获得抗猪HEV的三株单抗2C7,1E4和2G9。本研究通过原核表达sORF2-C截短蛋白、合成短肽等方法验证三株单抗在ORF2的结合位点,利用模拟病毒的sp239蛋白吸附HepG 2细胞,以及作为HEV感染动物模型的兔子设计试验,验证单抗在体外和体内的抗病毒中和作用,以及单抗识别表位的免疫保护作用。本研究主要内容和结果如下:1.抗猪HEV衣壳蛋白单抗识别抗原表位的鉴定原核表达sORF2-C截短蛋白后,用Western blotting与间接ELISA方法与单抗反应,找到其结合区域（4-7个氨基酸）,进一步合成短肽确定位于基因4型HEV衣壳蛋白上三株单抗2C7、2G9和1E4识别的表位分别为407EPTV410,458PSRPF462和625DFCP628。1B5是经实验室前期验证在猪、人、禽HEV上识别共有表位410VLYTS411的单抗。空间结构预测验证了2C7、2G9和1B5识别的表位部分位于病毒表面,预示其可能具有抗病毒中和活性。同时,病毒捕获试验结果显示单抗2G9,1B5和2C7分别在400,400和200 ng/孔的包被浓度下可以捕获到天然病毒;而1E4和小鼠阴性IgG均未捕获到病毒。此外,序列分析比对发现2C7、2G9和1B5识别的三个表位在人、猪、兔及等其他动物源HEV中高度保守。2.抗猪HEV衣壳蛋白单抗抗病毒中和活性的鉴定有研究显示原核表达基因1型HEV p239（368-606）蛋白可模拟病毒吸附HepG 2细胞。因此,本研究通过原核表达基因4型猪HEV ORF2对应区域的截短蛋白,命名为sp239（aa 368-606）,证明其在PB7.5溶液中组装形成多聚体。经IFA、Western blotting、FCM和RT-PCR验证,sp239可模拟病毒吸附并进入HepG 2细胞,此外,2G9、2C7和1B5均可在体外部分阻断sp239或病毒（利用低效病毒感染细胞系HepG 2）吸附HepG 2细胞;同时,本试验利用兔子作为HEV感染动物模型,将2G9、2C7和1B5（1E4与阳性血清作为阴、阳型对照组,同时设置正常组和仅攻毒组）与猪HEV粪便悬液孵育混合后接种兔子,检测其粪便排毒、病毒血症和抗体水平,发现单抗或阳性血清均能部分阻断病毒感染兔子,或相较于攻毒组,出现粪便排毒延迟现象。以上结果说明,2G9、2C7和1B5具有中和猪HEV的活性,其识别的抗原表位可作为潜在的疫苗设计靶点。3.基因4型猪HEV中和表位免疫保护效果研究基因4型猪HEV ORF2衣壳蛋白的三株单抗2G9、2C7和1B5经体内验证具有中和病毒活性,提示其识别的表位可能产生抗HEV中和抗体。因此,本试验根据三株中和表位设计合成短肽:Pep EPTV（2G9）、Pep VKLYTS（1B5）、Pep PSRPF（2C7）、Pep EPTVKLYTS（2G9-1B5）和Pep EPTVKLYTSPSRPF（2G9-1B5-2C7）;将以上短肽分别连接KLH及BSA用于免疫和检测。合成后将短肽皮下免疫兔子,待抗体水平达到峰值并稳定后耳缘静脉攻毒猪HEV,攻毒后每周检测粪便排毒、病毒血症和抗体水平等指标发现:免疫短肽Pep EPTVKLYTSPSRPF或sp239后,兔子未出现HEV所引起的致病性反应,说明上述短肽对兔子感染基因4型猪HEV具有良好的保护效果;此外,免疫短肽Pep VKLYTS,Pep PSRPF,Pep EPTV和串联表位短肽Pep EPTVKLYTS对兔子产生部分保护作用。综上所述,本研究中抗基因4型猪HEV的三株单抗2G9,1B5和2C7经体内、外试验均验证其具有抗病毒中和活性;鉴定其识别HEV ORF2上的表位分别为407EPTV410,410VKLYTS411和458PSRPF462,据此合成短肽并设计动物试验验证其可在兔子体内产生保护性抗体,保护兔子免受基因4型猪HEV的感染。因此,以上试验结果为HEV疫苗设计提供靶点和理论依据,对于HEV的防控有积极意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要符号对照表
• 第一章 文献综述
•   1.1 戊型肝炎的病原学
•     1.1.1 HEV基因组结构
•     1.1.2 HEV病毒粒子的组装与释放
•     1.1.3 HEV的病理生理学
•   1.2 戊型肝炎的流行病学
•     1.2.1 HEV的传播途径
•     1.2.2 HEV在全球范围内的传播
•   1.3 HEV感染的动物模型建立
•     1.3.1 非人类灵长类动物模型
•     1.3.2 猪作为HEV动物模型
•     1.3.3 禽作为HEV动物模型
•     1.3.4 兔作为HEV动物模型
•     1.3.5 啮齿类动物作为HEV动物模型
•     1.3.6 雪貂作为HEV动物模型
•     1.3.7 鱼作为HEV动物模型
•     1.3.8 人源化肝脏嵌合小鼠作为HEV动物模型
•   1.4 HEV的检测及预防
•     1.4.1 抗HEV抗体检测
•     1.4.2 HEV RNA的检测与定量
•     1.4.3 HEV的衣壳蛋白抗原检测
•     1.4.4 HEV的预防措施
•   1.5 HEV ORF2 功能及抗原表位疫苗研究进展
•     1.5.1 HEV ORF2 的宿主互作与细胞间转导
•     1.5.2 HEV ORF2 与内质网应激反应（ERSR）
•     1.5.3 HEV的 B细胞表位
• 第二章 抗猪HEV衣壳蛋白单抗识别抗原表位的鉴定
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 质粒
•     2.2.2 杂交瘤细胞及单克隆抗体
•     2.2.3 多肽
•     2.2.4 抗HEV血清
•     2.2.5 主要试剂
•     2.2.6 主要仪器
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 原核表达HEV ORF2 不同截短蛋白
•     2.3.2 杂交瘤细胞和IgG单抗分子纯化
•     2.3.3 原核表达截短蛋白的鉴定
•     2.3.4 合成短肽间接ELISA确认单抗识别的位点
•     2.3.5 验证单抗识别抗原表位位于抗原表面
•     2.3.6 三株单抗识别的抗原表位为人、猪、兔和禽等多物种HEV所共有
•   2.4 试验结果
•     2.4.1 ORF2 截短蛋白的表达与纯化
•     2.4.2 Western blotting及间接ELISA验证单抗与HEV ORF2 的结合位点
•     2.4.3 短肽合成精确验证单抗所识别的氨基酸位点
•     2.4.4 单抗2G9,2C7和1B5 所识别的抗原表位部分位于猪HEV病毒颗粒表面
•     2.4.5 三株单抗识别的抗原表位为人、猪、兔和禽等多物种HEV所共有
•   2.5 讨论
•   2.6 小结
• 第三章 抗猪HEV衣壳蛋白单抗抗病毒中和活性的鉴定
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 病毒、细胞系和试验动物
•     3.2.2 主要试剂
•     3.2.3 主要仪器
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 基因4 型猪HEV sp239 蛋白的表达及纯化
•     3.3.2 Western blotting检测
•     3.3.3 IFA和 FCM检测
•     3.3.4 Real-time RT-PCR检测单抗阻断猪HEV吸附HepG2 细胞
•     3.3.5 单抗阻断猪HEV感染兔子试验
•   3.4 试验结果
•     3.4.1 基因4 型猪HEV sp239 蛋白可以组装形成多聚体
•     3.4.2 2 C7,2G9和1B5 阻断sp239 或病毒吸附HepG2 细胞
•     3.4.3 2 C7,2G9和1B5 阻断猪HEV感染兔子体内试验
•   3.5 讨论
•   3.6 小结
• 第四章 基因4 型猪HEV中和表位免疫保护效果研究
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 合成短肽、sp239 蛋白以及HEV ORF3 蛋白
•     4.2.2 猪HEV毒株和实验动物
•     4.2.3 主要试剂
•     4.2.4 主要仪器
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 短肽合成设计
•     4.3.2 动物试验设计及样品收集
•     4.3.3 间接ELISA及 RT-PCR分别检测样品中抗体和病毒RNA
•     4.3.4 解剖学和病理学观察
•     4.3.5 血清ALT水平测定
•   4.4 试验结果
•     4.4.1 攻毒前抗体水平检测
•     4.4.2 攻毒后抗体水平、粪便排毒及病毒血症检测
•     4.4.3 定量检测血清样品中的HEV RNA
•     4.4.4 血液中ALT（谷丙转氨酶）水平检测
•     4.4.5 解剖学和病理学观察
•   4.5 讨论
•   4.6 小结
• 全文总结
• 本研究创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 陈宜阳

导师: 周恩民

关键词: 猪戊型肝炎病毒,中和表位,疫苗设计

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家自然科学基金国际合作研究重点项目(31720103919),国家自然基金面上项目(31402233和31672583)

分类号: S852.651

DOI: 10.27409/d.cnki.gxbnu.2019.000058

总页数: 103

文件大小: 5683K

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