张林艳1林清2周杜娟1
（1福州神经精神病防治院神经内科350008；2福建医科大学基础医学院350108）
【摘要】目的观察丁苯肽对大鼠脑缺血再灌注神经保护的作用。方法将30只大鼠分成假手术组（10只）、模型组（10只）、干预组（10只）。Longa法线栓法制备大鼠缺血再灌注模型。缺血2小时再灌注24小时后对各组大鼠进行神经功能缺损评分，TTC染色观察脑梗死灶面积，免疫组化法检测caspase-3的表达变化。结果干预组、模型组与假手术组对比，脑梗死灶的caspase-3阳性细胞增加；丁苯酞干预组与模型组对比：1、神经功能缺损程度比减轻，2、脑梗死灶体积减小，3、caspase-3阳性细胞表达减少。结论丁苯肽对大鼠脑缺血有一定的预防作用。
【关键词】丁苯酞脑缺血脑梗死面积caspase-3
【中图分类号】R743【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）44-0093-02
缺血性脑血管病是危害人类健康的常见病，具有较高的致残率和致死率。脑缺血再灌注损伤主要的发病机制之一是细胞凋亡[1]，因此抗凋亡是治疗缺血性脑血管病的新靶点。
1材料与方法
1.1实验动物健康Sprauge-Dawley雄性大鼠，体重250-300克，购自中国科学院上海实验动物中心SCXK（泸）：2007-0005，自由饮食，室温22-25℃，每日光照12h。线栓（直径0.26mm）。
1.2实验材料TTC染色剂（Sigma，美国），DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司，丁苯肽胶囊（0.2克/粒，石药集团恩必普药业有限公司生产），4-0尼龙单线，兔抗大鼠caspase-3抗体购自Bioworldtechnology公司。
1.3实验方法
1.3.1模型制备
模型制作根据Longa法[2]进行改良。10％水合氯醛腹腔麻醉，参照Longa线栓法，加以改进，自制直径为0.26mm的尼龙线栓子制备大鼠大脑中动脉闭塞模型(MCAO)。缺血2h后拔除尼龙线10mm，造成脑缺血再灌注损伤模型。假手术组除不插入栓线外，其余手术过程皆同大脑中动脉线栓模型手术。神经病学评分采用Longa5级4分法：1分～3分为模型成功标志，首次评分为0分或4分、有呼吸困难、提前死亡及处死时发现有蛛网膜下腔出血的动物均弃之不用。
1.3.2给药方法
将丁苯酞胶囊用生理盐水稀释成药物浓度为8mg/ml混悬液，干预组术前5d开始以80mg/kg丁苯酞灌胃，假手术组和模型组给予等剂量生理盐水灌胃。连续灌胃2周。
1.3.3TTC染色
每组随机取5只大鼠，断头取脑，用排刀从前极开始每隔2mm行冠状切片，共5片。置于2%氯化-2.3.5-三笨四氯唑（TTC）溶液，37℃避光染色30min，正常脑组织被染成玫瑰红色，梗塞灶为白色。转至10%福尔马林固定，用数码相机拍摄。利用图像分析法计算各个脑片梗死面积。
1.3.4免疫组织化学
石蜡切片常规脱蜡至水，过氧化氢封闭，抗原热修复20min，血清封闭，抗体稀释液1:100稀释caspase-3抗体，滴加caspase-3抗体，4℃孵育过夜，次日室温复温30min，移去caspase-3抗体，PBS冲洗，DAB显色，脱水透明封片，显微镜观察。阳性细胞胞浆呈棕黄色，于阳性细胞分布区随机选择5个不重复的高倍镜(10×40)视野，计算caspase-3阳性细胞率。
1.4统计学处理
所获数据均为正态分布，采用x-±s表示，SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析和t检验。
2结果
2．1神经功能缺损评分及脑梗死面积测定见（表1）
表1丁苯酞对大鼠脑组织梗死面积及神经功能缺损评分的影响
组别n梗死面积（mm2）神经功能缺损评分/分
假手术组10010.28±0.071
模型组1026.38±5.161.78±0.46
干预组1017.52±4.2121.19±0.222
注：与模型组相比，1P＜0.01，2P＜0.05。
2.2免疫组化检测caspase-3表达
假手术组caspase-3阳性细胞仅少数表达，模型组caspase-3阳性细胞表达的数量较多；干预组caspase-3阳性细胞数量比模型组减少。（见图1）
图1caspase-3阳性细胞在各组脑组织内表达阳性率的比较
假手术组模型组干预组
3讨论
脑组织发生缺血性改变后，梗死灶中心以细胞死亡为主，而在梗死灶边缘；Caspase家族是细胞凋亡过程中重要的蛋白酶，Caspase-3是半胱天冬酶家族成员之一，参加细胞凋亡信号，它是各种细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，是凋亡的关键酶和执行者，同时也是许多神经细胞凋亡的重要效应蛋白；在各种程序启动的凋亡程序中起最后枢纽的作用。
丁苯酞有效成分均为消旋-3-正丁基苯酞（NBP），本品通过提高脑血管内皮NO和PGI2的水平，降低细胞内钙浓度，抑制谷氨酸释放，降低花生四烯酸含量，抑制氧自由基和提高抗氧化酶活性等机制作用于脑缺血的多个病理环节。大量的动物实验[3]及临床研究[4]表明，丁苯酞对急性缺血性脑血管病有确切疗效。
本实验结果显示，与假手术组对比，模型组Caspase-3的表达水平明显升高；干预组的Caspase-3的表达水平比模型组减低。因此，对Caspase-3进行早期干预，有可能降低细胞凋亡，进而减轻缺血性损伤。证实了丁苯酞可明抑制脑缺血再灌注损伤后的细胞凋亡，减小梗死范围，改善神经功能缺损症状。本研究为应用丁苯酞抗脑缺血再灌注后细胞凋亡提供了依据。
参考文献
[1]AbasF，AlkanT，GorenB，etal.Neuroprotectiveeffectsofpostconditioningonlipidperoxidationandapoptosisafterfocalcerebralischemia/reperfusioninjuryinrats［J］.TurkNeurosrg，2010，20(1):1－8．
[2]LongaEZ，WeinsteinPR，Cansons,etal.Reveersiblemiddlecerebralarteryoeelusionwithouteranieetomyinrats[J].AndineP，etal.Neuropathologicalendpointsinexperimentalstrokepharmacotherapy：theimportanceofbothearlyandlateevaluation[J].ActaNeurochir，1994，129（1-2）：58—63.
[3]李国前，王杰华，杨小霞，等.丁苯酞对大鼠脑缺血再灌注损伤后凋亡相关因子表达的影响［J］.中国临床药STROKE,2001,20(1):84-91.
[4]崔丽英，李舜伟，吕传真，等.恩必普软胶囊治疗中度急性缺血性卒中的多中心开放临床研究［J］.中国脑血管病杂志，2005，2(3)：112-115．