拟南芥下胚轴向光性缺失突变体rpt2抑制子的筛选与鉴定

论文摘要

为适应环境,植物进化出了一系列行使特殊功能的光受体,来感受自然界中不同波长的光,如:红光和远红光受体光敏色素、紫外线受体UVR8、蓝光受体隐花色素和向光素等。其中,向光素PHOTs（PHOT1和PHOT2）作为蓝光受体,参与诸多植物运动调节,如植物向光性、叶绿体运动、气孔开放等。目前关于PHOT1调节弱蓝光诱导的向光弯曲机制较为清晰,然而PHOT1和PHOT2以功能冗余的方式调节强蓝光诱导的向光弯曲机制并不清楚。我们课题组前期发现,基因PHOT1突变,拟南芥表现弯曲增强,在phot1突变体中超表达PHOT2基因拟南芥向光性进一步增强,而phot1 phot2双突变体缺失向光性,表明PHOT1在感受强蓝光后启动促进和抑制向光性的双重反应以适应光环境。结合拟南芥rpt2突变体缺失向光性,而phot1 rpt2双突变体却恢复向光弯曲,推测PHOT1介导的旁路抑制途径位于RPT2上游。为解析植物应答强蓝光选择最佳生长取向避免强光伤害的机制,本课题以rpt2突变体为材料进行EMS（Ethylmethane sulphonate）诱变,筛选恢复下胚轴向光弯曲的双突变体,即寻找RPT2基因的抑制子,希望解析PHOT1参与的强光抑制弯曲的机制。通过单侧强蓝光处理EMS诱变rpt2突变体M2突变群体,共筛选到18株恢复下胚轴向光弯曲并能稳定遗传的突变体,背景纯合鉴定发现这18个突变体均含RPT2基因纯合突变。强弱蓝光单侧处理这些突变体观察其向光弯曲发现:单侧强蓝光处理,line-40和line-124的弯曲度较小,其他突变体的弯曲度与野生型相似;单侧弱蓝光处理,line-40,101,128,155向光弯曲,而其余突变体均缺失向光弯曲。遗传分析显示,line-12,40,43,52,56,101,145,155弯曲恢复性状是隐性突变,其中,line-52与line-56弯曲恢复性状是由单基因隐性突变所致,可以进行下一步的克隆工作。我们对line-52突变体进行BSA关联定位分析,获得AT1G027XX,AT3G467XX,AT3G518XX,AT3G149XX,AT3G191XX,AT3G280XX,AT3G526XX等7个候选突变基因。订购候选基因的T-DNA插入单突种子,鉴定到纯合体后,检测单突在强蓝光下的表型发现at3g149XX和at1g027XX不能向光弯曲。为鉴定候选基因是否调节强光抑制,我们构建了候选基因的回补和超表达载体,并转化line-52双突变体,目前六个基因已经得到了转基因T2代材料,同时将候选基因的纯合单突变体分别与rpt2突变体杂交构建双突变体,目前已经获得RPT2基因纯合突变,另一基因杂合突变的状态。而候选基因是否为目标抑制子基因,需要得到其纯合双突变体材料后再做验证。与此同时,我们从RPT2基因的抑制子角度对line-52突变体的突变位点进行图位克隆,通过粗细定位将突变位点锁定在三号染色体的中下部“H9P21”这个BAC clone附近。鉴于line-52缺失弱蓝光下的向光弯曲表现PHOT1基因突变表型,不同于rpt2单突变体表型,暗示line-52中未知基因的突变导致拟南芥弱蓝光下的向光性缺失,因此在排除了PHOT1基因发生突变后,以弱蓝光角度建库克隆line-52突变体。通过扩大样本量的细定位最终将突变位点区间锁定在“H6P9”和“H9P21”这两个紧密相邻的BAC上。通过对定位区间的扩增测序,发现基因“H9-7”发生碱基插入突变,结合前人研究,我们推测该基因可能与可变启动子对转录过程的调控有关,通过影响相关蛋白的表达模式,从而导致向光弯曲的发生。随后,我们将构建该基因的CAS9载体转化rpt2,以及双突构建对该基因进行功能验证。此外,我们研究line-52生长发育各个阶段的特征,发现line-52的莲座叶比rpt2更加宽大、伸展,暗示该抑制子基因可能也参与叶片定位和伸展的调控。设置不同强度的蓝光处理下的狭缝实验发现rpt2单突变体无叶绿体聚光现象,而line-52一定程度恢复了叶绿体聚光运动,暗示该抑制子基因可能还参与叶绿体聚光的调控。综上所述,我们建立了单侧强蓝光筛选拟南芥下胚轴向光弯曲缺失突变体rpt2抑制子的筛选体系,并成功筛选到18个稳定遗传突变体,其中8突变体被证明是隐性突变,2个被证明是单基因隐性突变所致。通过BSA分析和图位克隆获得了line-52双突变体可能的突变基因。对上述突变体的遗传表型分析及可能突变基因功能预测,初步证明了RPT2抑制子可能参与下胚轴向光弯曲、叶绿体聚光运动以及叶片定位与伸展过程的调控,将为解析植物通过向光性运动以适应光环境变化的调控机制提供重要基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要英文缩写表
• 1 前言
•   1.1 向光素以及NRL家族主要成员的发现
•     1.1.1 PHOT1 的发现与鉴定
•     1.1.2 RPT2与NPH3 的发现与鉴定
•     1.1.3 NCH1 的发现与鉴定
•   1.2 NRL家族成员参与向光素相关反应的调控
•     1.2.1 NPH3和RPT2 参与根负向光性反应的调控
•     1.2.2 NPH3与RPT2 差异调控下胚轴向光性反应
•     1.2.3 RPT2与NPH3 对叶片定位和展平至关重要
•     1.2.4 RPT2与NCH1 对叶绿体聚光反应的调控有重要作用
•     1.2.5 RPT2 不参与气孔开放的调控
•   1.3 关于NRL家族成员研究进展的思考
•   1.4 基于图位克隆和二代测序的抑制子筛选技术
•   1.5 基因RPT2 抑制子的筛选依据及研究意义
• 2 材料与方法
•   2.1 实验所用材料
•     2.1.1 拟南芥材料
•     2.1.2 质粒与菌株
•   2.2 实验所用仪器与试剂
•     2.2.1 仪器
•     2.2.2 试剂来源
•     2.2.3 常用溶液的配制方法
•   2.3 实验中所用的引物合成
•   2.4 技术与方法
•     2.4.1 拟南芥的繁殖
•     2.4.2 基于单侧蓝光处理的筛选条件
•     2.4.3 拟南芥DNA的粗提取
•     2.4.4 载体的构建以及转基因植株的获得
•     2.4.5 拟南芥的杂交技术
• 3 结果与分析
•   3.1 突变体的筛选和遗传鉴定
•     3.1.1 向光弯曲恢复突变体的筛选
•     3.1.2 向光弯曲恢复突变体的遗传稳定性鉴定和弯曲度分析
•     3.1.3 稳定遗传突变体在单侧弱蓝光处理下的表型鉴定
•     3.1.4 稳定遗传突变体中rpt2 纯合突变背景的鉴定
•     3.1.5 稳定遗传突变体与rpt2 回交F1 代的遗传分析
•     3.1.6 稳定遗传突变体回交F2 代的分离比统计
•   3.2 突变体line-52的BSA分析以及验证
•     3.2.1 BSA分析的送样准备以及结果验证
•     3.2.2 BSA候选基因的纯合体鉴定以及双突变体的构建
•     3.2.3 候选基因单突变体的强蓝光表型鉴定
•     3.2.4 候选基因单突变体的弱蓝光表型鉴定
•     3.2.5 BSA候选基因的表达量检测
•     3.2.6 候选基因的回补和超表达载体构建
•   3.3 突变体line-52 的图位克隆
•     3.3.1 克隆RPT2 基因抑制子的群体构建
•     3.3.2 抑制子突变体line-52 的粗定位结果
•     3.3.3 抑制子的细定位结果
•     3.3.4 从突变体角度对line-52 进行克隆的依据
•     3.3.5 突变体line-52 混池粗定位结果
•     3.3.6 突变体line-52 细定位结果
•     3.3.7 优化建库条件对细定位结果进行验证
•     3.3.8 对定位区间测序寻找突变基因
•   3.4 突变体line-52 的其他向光性表型分析
•     3.4.1 叶绿体运动的表型探索
•     3.4.2 莲座叶的表型探索
• 4 讨论
•   4.1 RPT2在PHOT1 介导的向光弯曲反应中处于中枢地位
•   4.2 RPT2 抑制子基因的筛选
•   4.3 RPT2 抑制子基因的其他功能预测
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 马世凡

导师: 张骁,赵翔

关键词: 强蓝光抑制,抑制子,图位克隆,性状关联分析

来源: 河南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 河南大学

分类号: Q943.2

总页数: 69

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