论文摘要
[目 的]Cathelicidins是脊椎动物所特有的一种宿主防御分子,在机体内承担着重要的生物学功能,如抗微生物,抗炎、抗氧化、促进伤口愈合和血管生成等活性。研究人员在水生和陆生脊椎动物中已发现多种cathelicidins分子,并对它们的结构和功能都进行了较为详尽的研究,尤其是人源的cathelicidins分子（LL-37）。两栖动物是水生和陆生脊椎动物之间的过渡类型,目前在两栖动物数据库（http://www.amphibiaweb.org/）中记录的两栖动物约7937种,然而有关两栖动物中cathelicidins分子的结构与功能相关研究较少。目前仅在两栖纲有尾目的红瘰疣螈（Tylototriton verrucoosus Anderson）中分离纯化出具有创伤修复活性的cathelicidins分子（tylotoin）,但是从无尾目中分离出来的cathelicidins分子还鲜有报道。我们以生活在高寒地区,强紫外线,日照时间长,两栖纲无尾目的高原腹斑倭蛙（Nanorana ventripunctata）为研究对象,结合其生存策略,筛选高原腹斑倭蛙体内的促皮肤修复相关分子,并研究其结构与可能具有的功能。[方 法]收集高原腹斑倭蛙皮肤分泌液后,我们使用sephadex G-50层析柱和RP-HPLC对皮肤分泌液进行分离纯化,收集具有促进细胞迁移活性的峰,对其一级结构进行测定。同时从倭蛙皮肤中提取RNA,构建cDNA文库,合成多肽。然后对合成的样品以及分离纯化得到的样品进行功能鉴定。使用最小抑菌浓度法MIC（Minimal inhibitory concentration）检测样品抗菌活性（15株菌株,其中革兰氏阳性菌7株,革兰氏阴性菌6株,真菌2株）;MTT法检测HaCaT细胞和HSF细胞增殖情况;细胞划痕实验检测HaCaT细胞迁移;ELISA检测小鼠腹腔巨噬细胞 RAW264.7 中 MCP-1,TGF-β1,TNF-α,VEGF 的分泌水平;Western blot法检测MAPK家族蛋白表达水平;小鼠全层皮肤创伤模型检测促创伤修复活性;HE染色法检测伤口部位表皮再生情况以及胶原分布;免疫组化法检测伤口部位肌成纤维细胞数量变化。[结 果]通过分离纯化的方法,我们从高原腹斑倭蛙（Nanorana ventripunctata）皮肤分泌物中分离纯化的具有促进创伤修复活性的多肽,通过Edman降解法测得其N端到C端的成熟肽氨基酸序列为ARGKKECKDDRCRLLMKRGSFSYV,分子克隆结果显示其前体部分由146个氨基酸构成,BLAST序列比对发现该多肽属于cathelicidins家族一员,故将其命名为cathelicidin-NV。MALDI-TOF检测到其相对分子质量为2845.9 Da,而其理论分子量为2847.34 Da,仅相差1.47 Da,提示Cys7-Cys12形成一对分子内二硫键。MIC结果表明cathelicidin-NV在浓度高达200 μg/ml时,对受测菌株没有直接的抗菌活性。MTT法检测显示cathelicidin-NV能促进HaCaT细胞和HSF细胞的增殖。划痕实验结果显示cathelicidin-NV 能促进 HaCaT 细胞迁移。ELISA 实验结果显示 cathelicidin-NV能够促进 RAW264.7 细胞分泌 TGF-β1,TNF-α,VEGF 和 MCP-1。Western blot检测显示cathelicidin-NV能上调P-P38,P-ERK的表达,但是对JNK没有影响。在小鼠创全层皮肤伤口伤模型实验中,与阴性对照相比,cathelicidin-NV能有效促进小鼠全层皮肤伤口愈合。HE染色结果显示cathelicidin-NV能够加速创口部位表皮再生以及促进胶原生成。免疫组化结果表明cathelicidin-NV能促进创口部位的成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。[结 论]我们从高原腹斑倭蛙（Nanorana ventripunctata）皮肤分泌液中分离纯化出一种新的创伤修复肽,BLAST序列比对发现该多肽属于cathelicidins家族一员,故将其命名为cathelicidin-NV。该成熟肽的氨基酸序列为ARGKKECKDDRCRLLMKRGSFSYV,MALDI-TOF 检测到其相对分子质量为2845.9 Da,而其理论分子量为2847.34 Da,是因为Cys7-Cys12形成一对分子内二硫键。MIC结果表明cathelicidin-NV在浓度高达200 μg/ml时,对受测菌株没有直接的抗菌活性。Cathelicidin-NV能够从体外和动物模型上促进小鼠全层皮肤伤口愈合,主要通过以下四个方面发挥促进创伤修复的功能:1、Cathelicidin-NV可以直接促进受伤部位HSF细胞的增殖,从而加快肉芽组织的形成。2、Cathelicidin-NV可以直接促进表皮细胞HaCaT细胞的增殖和迁移,从而加速受伤部位的表皮生长。3、Cathelicidin-NV促进MCP-1分泌,从而募集巨噬细胞聚集,分泌大量的TGF-β1,TNF-α,VEGF,通过这些细胞因子来激活增殖相关信号通路。4、Cathelicidin-NV通过激活MAPK增殖信号通路来促进伤口愈合。Cathelicidin-NV与目前临床上使用的皮肤修复药物（重组人表皮生长因子凝胶）相比,能够快速促进伤口愈合,在动物身上能够达到无疤痕的治疗效果,且具有分子量小,发挥作用后易于降解,合成方法相对简单,成本相对较低的特点,可以为将来皮肤伤口愈合药物开发提供先导分子和模板。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 杨俊
导师: 杨海龙
关键词: 高原腹斑倭蛙,皮肤,创伤修复
来源: 昆明医科大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 昆明医科大学
基金: 国家自然科学基金
分类号: Q958
DOI: 10.27202/d.cnki.gkmyc.2019.000396
总页数: 68
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