紫花苜蓿3-酮酰辅酶A合成酶基因（MsKCS10）的克隆与功能分析

论文摘要

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是世界上重要的多年生优质牧草,具有产量高、品质好的特点。然而,由于全世界范围内干旱和盐胁迫灾害的日益加剧,其生长范围受到严重限制。随着分子育种的兴起,利用生物工程技术培育适应不良环境的新型作物,这为紫花苜蓿育种在抗旱、抗盐方面提供了理论依据。表皮蜡质是覆盖在植物表面的角质层组成部分。蜡质的积累与防止水分散失相关,有助于抗旱耐盐。而植物蜡质由超长链脂肪酸（Very Long Chain Fatty,VLCFAs）和其他衍生物共同组成。在超长链脂肪酸合成中,主要由复合酶——脂肪酰辅酶A延长酶（Fatty Acyl-enzyme A）催化完成。3-酮脂酰辅酶A合成酶（3-ketoacyl-CoA synthase,KCS）作为复合酶FAE中的限速酶,在下游产物的合成中起关键作用。本文基于RACE技术,从紫花苜蓿中克隆一个基因MsKCS10,从该基因功能、特性方面进行了研究。研究结果如下:1.利用实验室前期基因芯片数据,使用PCR方法从紫花苜蓿叶片中克隆KCS10中间片段序列。采用RACE技术,扩增该中间片段得到基因全长,命名为MsKCS10。测序结果表明,其基因全长（gene full length）为1889bp,开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）共1614bp,能编码氨基酸537个,GeneBank登录号为MK625177。序列比对后发现,该MsKCS10基因与蒺藜苜蓿KCS10基因的同源性为98.36%。利用neighbor-joining方法构建系统进化树,其分析表明MsKCS10基因和蒺藜苜蓿KCS10基因的同源性最高。使用实时定量PCR（Real-time quantitative PCR,RT-qPCR）分析其在各组织间的表达情况,结果表明:MsKCS10主要在叶和茎中表达,在根中几乎不表达。另外,利用RT-qPCR技术分析MsKCS10基因在9个品种的紫花苜蓿地上部分的表达情况。此外,该基因的转录表达还受逆境胁迫诱导,分析表明,在干旱条件下,MsKCS10上调较快,而在盐胁迫下,上调缓慢。2.构建瞬时表达载体pCAMBIA1300-MsKCS-GFP,使用农杆菌介导法注射在烟草叶片上进行亚细胞定位研究,结果表明,该基因定位在内质网上;构建过表达载体pCAMBIA1301-MsKCS,利用农杆菌介导及叶盘法,侵染烟草,组培后经检测成功获得MsKCS10过表达烟草。过表达植株经自然光干旱胁迫、补充光照干旱和盐胁迫后,其生理生化指标均优于对照组。此外,在烟草叶片中过表达MsKCS10,发现直链烷烃含量和脂肪酸含量增加。且直链烷烃含量的增加主要集中在C31和C33烷烃;脂肪酸含量的增加集中在C20和C22脂肪酸,说明MsKCS10参与烟草蜡质合成,并参与脱羰途径。扫描电镜结果发现,转基因烟草叶片上出现特殊形态的螺旋状蜡质晶体。叶绿素浸出试验数据表明,转基因烟草叶绿素浸出速率小于对照组。同时叶片失水速率试验测定表明,转基因烟草叶片的保水能力优于对照组3.基于GenBank果实特异性启动子PG基因的启动子区域设计特异引物,从Monkey-Maker番茄基因组中克隆番茄果实特异性启动子PG,构建果实特异启动子过表达载体PBI121-PG promoter-MsKCS,使用农杆菌介导法导入Micro-Tom番茄中,经植物组织培养和PCR检验,获得MsKCS10转基因番茄。试验后发现,转基因Micro-Tom番茄较对照组更耐存放。转基因番茄果皮蜡质的直链烷烃及脂肪酸和醛类物质增加。说明MsKCS10在转基因的番茄果实表皮的蜡质合成中,与在烟草叶片中一样,均参与脱羰途径。此外经电镜扫描后发现,转基因番茄表皮出现同转基因烟草叶片表皮相同的特殊蜡质晶体,这可能是由于直链烷烃及脂肪酸含量增加的共同作用;4.使用In-fusion构建过表达载体pCABIAM3301-MsKCS和采用Gateway方法构建得到干扰载体pK7GWIWG2-MsKCS。利用农杆菌介导法,经组织培养和检测,获得MsKCS10过表达紫花苜蓿和MsKCS10-RNAi干扰紫花苜蓿。对MsKCS10过表达紫花苜蓿和MsKCS10-RNAi干扰紫花苜蓿进行电镜扫描后发现,过表达苜蓿叶片表皮蜡质晶体有更浓密的片状蜡质结晶,干扰紫花苜蓿具有较稀疏的片状蜡质结晶。此外,过表达MsKCS10基因苜蓿有更高的C30醇含量、直链烷烃含量;RNAi-MsKCS10转基因苜蓿则表现出下降的C30醇含量、直链烷烃含量,说明MsKCS10在转基因紫花苜蓿叶片的蜡质合成中,既参与脱羰途径又参与酰基还原途径。综上所述,MsKCS10主要响应植物干旱胁迫,并且在转基因烟草叶片和番茄果实表皮的蜡质合成中,均参与脱羰途径。另外,在转基因烟草和转基因番茄果皮都出现螺旋状蜡质晶体沉淀,结合二者蜡质组分,这可能是由于直链烷烃及脂肪酸含量增加的共同作用。而MsKCS10在转基因紫花苜蓿叶片的蜡质合成中,既参与脱羰途径又参与酰基还原途径。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要符号对照表
• 第一章 文献综述
•   1.1 植物表皮结构
•     1.1.1 植物表皮角质层
•     1.1.2 蜡质生物学功能
•     1.1.3 蜡质化学组成成分
•     1.1.4 超长链脂肪酸延伸合成过程
•     1.1.5 蜡质晶体各种形态
•   1.2 植物蜡质合成相关基因研究进展
•   1.3 植物组织培养及转基因方法概述
•     1.3.1 组织培养技术
•     1.3.2 转基因方法
•   1.4 紫花苜蓿遗传转化研究进展
•     1.4.1 紫花苜蓿再生体系研究进展
•     1.4.2 紫花苜蓿转基因研究进展
•   1.5 本研究的目的、意义和试验技术路线
•     1.5.1 研究目的及意义
•     1.5.2 试验技术路线
• 第二章 紫花苜蓿MsKCS10 基因克隆
•   2.1 材料和方法
•     2.1.1 材料
•     2.1.2 紫花苜蓿MsKCS10 基因中间序列的克隆
•     2.1.3 紫花苜蓿KCS10 基因5’cDNA及3’cDNA RACE克隆
•     2.1.4 基因全长克隆
•     2.1.5 生物信息学分析
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 紫花苜蓿Total RNA质量检查
•     2.2.2 紫花苜蓿KCS基因RACE克隆
•     2.2.3 基因的生物信息学分析
•   2.3 讨论
•   2.4 小结
• 第三章 MsKCS10 基因的表达分析
•   3.1 材料
•     3.1.1 试验材料
•     3.1.2 生化试剂
•     3.1.3 仪器设备
•   3.2 方法
•     3.2.1 种子消毒及幼苗处理
•     3.2.2 RNA提取和反转录
•     3.2.3 引物设计
•     3.2.4 实时荧光定量检测MSKCS10 在植物中的表达
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 MsKCS10 基因在紫花苜蓿中的组织特异性表达
•     3.3.2 MsKCS10 基因在不同非生物胁迫下的表达分析
•   3.4 讨论
•   3.5 小结
• 第四章 MsKCS10 基因在不同品种紫花苜蓿中的表达分析
•   4.1 材料
•     4.1.1 试验材料
•     4.1.2 生化试剂
•     4.1.3 仪器设备
•   4.2 方法
•     4.2.1 种子萌发及移栽
•     4.2.2 RNA提取和反转录
•     4.2.3 引物设计
•     4.2.4 实时荧光定量检测MSKCS10在9 个品种紫花苜蓿中的表达
•   4.3 结果与分析
•   4.4 讨论
•   4.5 小结
• 第五章 MsKCS10 瞬时表达载体的构建和亚细胞定位研究
•   5.1 材料
•     5.1.1 试验材料
•     5.1.2 生化试剂
•     5.1.3 仪器设备
•   5.2 方法
•     5.2.1 构建MsKCS10 瞬时表达载体
•     5.2.2 制作农杆菌感受态
•     5.2.3 制作瞬时表达载体农杆菌
•     5.2.4 本氏烟草亚细胞定位
•   5.3 结果与分析
•   5.4 讨论
•   5.5 小结
• 第六章 MsKCS10 在烟草中的功能研究
•   6.1 材料
•     6.1.1 试验材料
•     6.1.2 生化试剂
•     6.1.3 仪器
•   6.2 方法
•     6.2.1 烟草过表达载体的构建
•     6.2.2 农杆菌介导的烟草转化流程
•     6.2.3 转基因烟草的鉴定
•     6.2.4 转基因烟草耐旱性鉴定
•     6.2.5 转基因烟草叶片扫描电镜观察
•     6.2.6 转基因烟草蜡质提取和气相色谱分析
•   6.3 结果与分析
•     6.3.1 组培烟草的过程
•     6.3.2 转基因烟草的鉴定
•     6.3.3 转基因烟草干旱胁迫后表型情况
•     6.3.4 胁迫处理后,转基因烟草各生理指标的测定结果
•     6.3.5 烟草叶片扫描电镜观察结果
•     6.3.6 烟草叶片表皮蜡质成分及含量
•   6.4 讨论
•     6.4.1 MsKCS10 基因对转基因烟草耐旱、耐盐性的影响
•     6.4.2 MsKCS10 基因对转基因烟草光和效应的影响
•     6.4.3 MsKCS10 基因对转基因蜡质合成的影响
•   6.5 小结
• 第七章 MsKCS10 在番茄中的功能研究
•   7.1 材料
•     7.1.1 试验材料
•     7.1.2 生化试剂
•     7.1.3 仪器
•   7.2 方法
•     7.2.1 番茄过表达载体的构建
•     7.2.2 农杆菌介导的番茄转化流程
•     7.2.3 转基因番茄的鉴定
•     7.2.4 番茄自然放置保水性试验
•     7.2.5 番茄果实扫描电镜观察
•     7.2.6 番茄果实蜡质提取和气相色谱分析
•   7.3 结果与分析
•     7.3.1 PG启动子电泳图
•     7.3.2 番茄组织培养过程
•     7.3.3 番茄转基因鉴定
•     7.3.4 野生型番茄和转基因番茄果实自然放置表型比较
•     7.3.5 番茄果实表皮扫描电镜观察结果
•     7.3.6 番茄果实表皮蜡质成分及含量
•   7.4 讨论
•   7.5 小结
• 第八章 MsKCS10 在紫花苜蓿中的功能研究
•   8.1 材料
•     8.1.1 试验材料
•     8.1.2 生化试剂
•     8.1.3 仪器
•   8.2 方法
•     8.2.1 紫花苜蓿过表达载体
•     8.2.2 紫花苜蓿干扰载体的构建
•     8.2.3 农杆菌介导的紫花苜蓿转化流程
•     8.2.4 转基因苜蓿的鉴定
•     8.2.5 紫花苜蓿叶片扫描电镜观察
•     8.2.6 紫花苜蓿叶片蜡质提取和气相色谱分析
•   8.3 结果与分析
•     8.3.1 苜蓿组织培养过程
•     8.3.2 苜蓿转基因鉴定
•     8.3.3 苜蓿叶片表皮扫描电镜观察结果
•     8.3.5 苜蓿叶片蜡质成分及含量
•   8.4 讨论
•   8.5 小结
• 第九章 结论
•   9.1 全文讨论
•   9.2 全文结论
•     9.2.1 紫花苜蓿KCS10 基因的克隆和表达分析
•     9.2.2 各个品种紫花苜蓿的MsKCS10 的相对表达量
•     9.2.3 紫花苜蓿KCS10 基因的功能验证
•   9.3 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘雨诗

导师: 呼天明

关键词: 紫花苜蓿,酮脂酰辅酶合成酶,蜡质,功能验证

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家自然基金项目“细胞水平多组学解析根瘤调节苜蓿抗旱性的分子机制”(31772660),“根瘤提高苜蓿气孔对ABA敏感性的抗旱分子机制研究”(31572456),农业部现代农业产业技术体系“国家牧草产业技术体系-榆林综合试验站”(CARS-34)

分类号: S541.9;Q943.2

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