导读:本文包含了泛素蛋白酶体通路论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:蛋白酶,动脉,酰胺,细胞,粥样,信号,体系。
泛素蛋白酶体通路论文文献综述
吴晓绵[1]（2017）在《泛素蛋白酶体系统SCR-βTrcp和CYLD通过NFκB信号通路对颅颌面组织改建的调控作用》一文中研究指出目的:NF?B信号通路在骨组织代谢,牙周炎症,体内植入物反应等方面都有重要的调控作用。1)泛素蛋白酶体系统SCR-βTrcp和CYLD分别为NF?B信号通路的激活酶和抑制酶。CYLD被证实对骨组织有重要的调控作用,基因敲除CYLD小鼠会出现骨质疏松等骨组织代(本文来源于《2017全国口腔生物医学学术年会论文汇编》期刊2017-10-13）
苏义,余昌胤[2]（2017）在《泛素蛋白酶体通路与阿尔茨海默病》一文中研究指出目的对泛素蛋白酶体通路与阿尔茨海默病之间的关系进行正确的认识,进一步了解AD的病理机制,明确AD治疗靶点。方法查阅相关研究文献资料,从AD的病理学特点、AD脑中APP的代谢、UPP系统的组成和功能、UPP与Tau的过度磷酸化聚集进行综述。结果和结论泛素蛋白酶体通路受抑制或功能缺陷在Tau的过度磷酸化/聚集和β-分泌酶活性增加引起Aβ聚集终致AD发病中至关重要。开发安全高效的泛素蛋白酶体调节剂发挥抑制BACE1的活性作用,减少Aβ增加聚集和Tau蛋白过度磷酸化等,抑制病理产物形成PHF,SP和NFTs的产生是科研新思路。(本文来源于《世界最新医学信息文摘》期刊2017年24期）
丁长钰[3]（2016）在《泛素—蛋白酶体系统在CQ抑制LPS-TLR4信号通路活化中的调控机制研究》一文中研究指出研究背景及目的:革兰阳性或革兰阴性细菌、病毒等病原微生物感染机体时,这些病原微生物释放LPS、肽聚糖(peptidoglycan,PGN)等活性成分,与炎症反应细胞的表面受体模式识别并结合,引起一系列胞内信号事件和效应分子的级联释放,介导脓毒症的发生发展。脂多糖/内毒素(endotoxin/lipopolysaccharide,LPS)是介导脓毒症发生最常见的致病因子,由类脂A、核心多糖和O-抗原叁部分共价连接而成。LPS与其模式识别受体TLR4(toll-like receptor 4)结合,沿着MyD88依赖及TRAM-TRIF依赖两条途径启动细胞内信号转导,活化NF-κB(nuclear factor kappa B)和IRF-3(interferon regulatory factor 3),导致肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、趋化因子等多种效应分子的合成和释放。4-氨基喹啉类抗疟药氯喹(chloroquine,CQ),是一种弱碱性药物,抑制内体和溶酶体的酸化成熟。本课题组早前发现,CQ显着提高脓毒症小鼠的总体生存率,负调控LPS刺激人外周血单个核细胞(human peripheral blood mononuclear cell,hPBMC)和小鼠巨噬细胞(ANA-1)上清中TNF-α和IL-6的释放。且其他研究同样证实CQ具有较广谱的抗炎活性,如CQ提高多种微生物混合感染所致脓毒症小鼠的总体生存率、减轻肾功能损伤和脾细胞凋亡。因此,本课题组从04年开始进行CQ抗炎的相关研究,并在前期大量工作中发现CQ抑制LPS介导单核/巨噬细胞的活化、影响LPS-TLR4复合物的内化和解离、影响细胞膜表面受体TLR4的表达等。此外,我们还发现,CQ上调小泛素相关修饰物特异性蛋白酶(SUMO-specific protease 6,SENP6)的蛋白表达,减少TNF-α、IL-6、IFN-γ等炎症介质的释放。SUMO是类泛素分子,酶催化下共轭结合在底物蛋白赖氨酸残基上的过程称为SUMO化(SUMOylation),是一种蛋白质翻译后修饰,调节蛋白质的亚细胞定位和空间结构,参与NF-κB通路和STAT信号调控。SUMO是酶催化的可逆反应,因此SUMO在泛素样修饰物蛋白酶(ubiquitin-like modifier protease,ULP)/去SUMO化酶催化下可从底物蛋白的赖氨酸残基上解离。SENP6是一种去SUMO化酶,介导IRF3或IRF7的去SUMO化负反馈抑制IFN的转录。我们研究发现CQ上调SENP6的蛋白表达,后者诱导NF-κB的去SUMO化,下调TNF-α、IFN-γ等炎症介质的释放。SUMO和泛素分子结构有高度的同源性,SUMO化和泛素化修饰过程相仿,虽然SUMO化和泛素化的修饰位点存在相互竞争,CQ可上调去SUMO化酶SENP6直接作用于NF-κB调节LPS诱导巨噬细胞活化,那么进行同向类比,CQ是否也可以上调去泛素化酶的表达作用于NF-κB之外的其他信号分子调控LPS-TLR4通路?泛素(ubiquitin)是由76个氨基酸组成的小分子蛋白,在E1、E2、E3的顺序作用下连接到底物蛋白赖氨酸残基,发挥不同的生物学功能。泛素和E1、E2、E3及26S蛋白酶体组成泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS),作为真核细胞中主要溶酶体非依赖的蛋白降解途径,参与炎症、信号转导、细胞凋亡等多种生物学活动。泛素在不同E2和E3的催化下通过其分子结构中存在的蛋氨酸和赖氨酸残基形成8种不同拓扑结构和功能的多聚泛素链,这个过程叫泛素化。泛素化是酶催化的可逆反应,去泛素化酶(deubiquitinases,DUBs)催化靶蛋白上连接的多聚泛素链与底物蛋白的解离。人基因组约编码五大类DUB,N末端卵巢癌型蛋白酶(ovarian tumor-type proteases,OTU)、泛素C末端水解酶(ubiquitin C-terminal hydrolases,UCH)、泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-specific proteases,USP)、马查多-约瑟夫病蛋白酶(Machado-Joseph disease proteases,MJD)和金属蛋白酶(metalloproteases),其中研究较多的是USP家族和OTU家族去泛素化酶。细胞表面受体的内化和转运同样参与细胞内信号转导,LPS与TLR4结合,内化进入早期内体,逐渐酸化成熟形成晚期内体并与溶酶体融合,在早期内体-晚期内体-溶酶体动态变化过程中,早期内体含有特殊的小半鞘,其中包含转运所需内体分选复合物(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT),由ESCRT分选出的泛素化标记的膜蛋白转运至溶酶体降解。有研究证实,E3或DUB与ESCRT的相互作用调节表面受体的内化和转运,调控细胞内信号转导。溶酶体主要参与内化物质的分解代谢和再循环,蛋白酶体则主要参与功能或结构异常蛋白的降解。既已证实CQ有较广谱的抗炎活性,且本课题组前期研究发现,CQ预处理Raw264.7细胞中LPS与TLR4共定位现象消失,且细胞膜表面TLR4受体表达减少;我们考虑CQ是酸化抑制剂,抑制内体和溶酶体酸化成熟,似乎CQ促进LPS-TLR4解离、降低膜表面受体TLR4的表达与溶酶体关联不大。因此我们进一步猜想CQ是否通过泛素-蛋白酶体途径增加LPS-TLR4的分离与降解而参与抑制LPS诱导巨噬细胞活化的?综上所述,本课题从CQ抑制LPS诱导巨噬细胞活化的研究切入,藉由泛素-蛋白酶体途径阻断对不同炎症介质释放的效应入手,阐述CQ负调控LPS-TLR4通路可能的分子机制。因此,本课题先筛选CQ对不同DUB分子mRNA表达的影响,进一步探讨锌指蛋白A20和泛素特异性蛋白酶USP25通过影响信号通路中间分子的活性,影响TLR4介导下游信号通路的活化和炎症介质释放的可能机制。研究方法:1.CQ影响OTU和USP家族去泛素化酶mRNA表达的筛选研究:20ug/ml终浓度CQ预处理Raw264.7细胞1h,加100ng/ml浓度的LPS刺激2h;荧光定量PCR检测DUBs的mRNA表达。2.锌指蛋白A20调控CQ抑制LPS-TLR4通路的机制研究:2.1 CQ对Raw264.7细胞A20表达水平的影响:用不同浓度(0、5、10、20ug/ml)CQ预处理Raw264.7细胞24h,A20的mRNA和蛋白表达水平以PCR和western blot(WB)法分别检测CQ对A20表达的剂量-效应关系;并以达到A20最大表达水平的剂量预处理Raw264.7细胞1h,LPS刺激4h确定CQ对LPS活化Raw264.7细胞中A20的mRNA和蛋白表达水平。2.2 siRNA沉默A20表达变化导致的LPS-TLR4通路的影响:(1)siRNA转染技术将公司设计合成的3条siRNA转染Raw264.7细胞24-48h,A20的基因及蛋白水平分别用PCR和WB评估不同的干扰表达效果,选择干扰效果最优的siRNA建立干扰模型;(2)siRNA干扰A20表达,CQ预处理1h,LPS刺激4h,RT-PCR检测TNF-α和IL-6的mRNA表达;WB检测MAPK p38及其磷酸化水平;(3)siRNA干扰A20,CQ预处理1h,LPS刺激1h,激光共聚焦检测NF-κB和IRF3的核转位情况。3.泛素特异性蛋白酶USP25调控CQ抑制LPS诱导巨噬细胞活化的机制研究:3.1 CQ影响Raw264.7细胞USP25表达情况:梯度剂量(0、5、10、20ug/ml)CQ预处理小鼠Raw264.7细胞或人THP-1细胞24h,PCR和WB分别检测USP25的mRNA和蛋白表达的剂量-效应关系;并以最大表达剂量的CQ预处理Raw264.7细胞1h,LPS刺激4h确定CQ对LPS活化Raw264.7细胞中USP25的mRNA和蛋白表达水平。3.2 siRNA干扰USP25表达对CQ抑制LPS诱导巨噬细胞活化的影响:(1)siRNA转染Raw264.7细胞24-48h,PCR和WB评估mRNA和蛋白水平干扰表达效果,建立干扰模型;(2)siRNA干扰USP25表达,CQ预处理1h,LPS刺激4h,RT-PCR检测TNF-α、IL-6和IFN-β的mRNA表达;WB检测TLR4下游信号分子IκB、NF-κB和MAPKs通路分子p38、ERK、JNK及其磷酸化水平;(3)si RNA干扰USP25表达,CQ预处理1h,LPS刺激24h,ELISA检测TNF-α、IL-6和IFN-β的释放水平;(4)siRNA干扰USP25表达,CQ预处理1h,LPS刺激4h或12h,ELISA检测NF-κB亚基p65和p50的活化情况;(5)siRNA干扰USP25,CQ预处理1h,LPS刺激1h,激光共聚焦检测NF-κB和IRF3转位入核变化;4.A20和USP25调控CQ抑制LPS诱导巨噬细胞活化的相互作用研究:(1)siRNA共转染双干扰A20和USP25,CQ预处理1h,LPS刺激24h,ELISA检测上清中TNF-α、IL-6和IFN-β的释放水平;(2)siRNA共转染双干扰A20和USP25,CQ预处理1h,LPS刺激4h,WB检测MAPK p38及其磷酸化水平;(3)siRNA共转染双干扰A20和USP25,CQ预处理1h,LPS刺激1h,激光共聚焦检测NF-κB和IRF3入核情况。5.统计学分析:计量资料以均值±标准差(X±S)表示,应用SPSS 13.0统计软件,采用单因素方差分析进行统计处理,以p<0.05为差异有统计学意义。研究结果:1.CQ影响OTU和USP家族去泛素化酶mRNA表达的筛选研究:PCR结果显示,CQ显着上调OTU家族去泛素化酶A20和OTULIN的mRNA表达;CQ上调USP家族去泛素化酶CYLD、USP2、USP3、USP4、USP7、USP8、USP25和USP28的mRNA表达。2.锌指蛋白A20调控CQ抑制LPS-TLR4通路的机制研究(1)A20的mRNA和蛋白表达与CQ存在正向剂量-效应关系,且A20的mRNA和蛋白表达在CQ预处理LPS刺激Raw264.7细胞中显着增加;(2)PCR和WB检测3条公司设计合成的siRNA序列发现siRNA1干扰效果最明显,因此以siRNA1建立干扰模型并应用在后续效应实验中;(3)A20干扰表达,TNF-α和IL-6的mRNA表达显着增加,p38磷酸化水平显着上调,且NF-κB p65和IRF3的转位入核明显增加。3.泛素特异性蛋白酶USP25调控CQ抑制LPS诱导巨噬细胞活化的机制研究(1)USP25的mRNA和蛋白表达与CQ存在正向剂量-效应关系,且在CQ预处理LPS刺激Raw264.7细胞中USP25的mRNA和蛋白表达也增加;(2)PCR和WB检测siRNA干扰mRNA和蛋白表达情况,成功建立干扰模型并应用在后续实验中;(3)USP25干扰表达,PCR结果显示,TNF-α、IL-6和IFN-β的mRNA表达明显增加;ELISA结果显示,上清中TNF-α、IL-6和IFN-β释放增加;WB结果显示,MAPK通路p38、ERK和JNK磷酸化水平明显上调,IκB降解增加,p-IκB磷酸化增加,NF-κB磷酸化也增加;NF-κB ELISA结果显示,NF-κB亚基p65和p50早期和晚期活化水平均明显增加;共聚焦结果显示,NF-κB和IRF3转位入核明显增加。4.A20和USP25调控CQ抑制LPS诱导巨噬细胞活化的相互作用研究:A20和USP25双干扰,ELISA结果显示,TNF-α和IL-6的释放减少,而IFN-β的释放增加;WB结果显示,p38磷酸化减少;共聚焦结果显示,NF-κB p65入核减少,而IRF3入核未见明显减少。研究结论:1.确定CQ预处理对DUB分子mRNA表达的调节作用,CQ上调多数USPs、A20及CYLD的mRNA表达。2.CQ预处理A20和USP25的表达上调可能改变LPS-TLR4通路中NF-κB外其他信号分子的生物学活性,进而影响NF-κB的活化和炎症介质的释放。A20或USP25干扰表达均会造成CQ抑制LPS-TLR4通路效应的阻断;但A20和USP25干扰表达CQ抑制NF-κB和MAPK通路的活化增加,抑制IRF通路的活化减弱,提示A20和USP25可能在LPS诱导MyD88和TRAM-TRIF两条信号通路中的存在不同和复杂的相互作用。3.CQ抑制LPS诱导巨噬细胞活化与泛素-蛋白酶体系统存在一定的关联,但泛素-蛋白酶体系统组成众多,调控精密复杂,因此CQ对LPS-TLR4通路的抑制作用可能需要多个DUBs的协同作用,从多方面多途径发挥其炎症抑制效应。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2016-11-01）
Zhang,B,L,Lin,M,Yu,C,N,Li,J,L,Zhang,L[4]（2016）在《饲料中添加丙氨酰对仔猪mTOR和泛素/蛋白酶体系统信号通路的影响》一文中研究指出试验旨在探讨丙氨酰-谷氨酰胺双肽(Ala-Gln)、游离丙氨酸和谷氨酰胺复合物(Ala+Gln)对仔猪雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路和泛素-蛋白酶体系统(UPP)信号通路的影响。将180头仔猪随机分配,共3个处理组,每组3个重复,每个重复20头,饲料中分别添加Ala 0.62%、Ala-Gln 0.5%、Ala 0.21%+Gln 0.34%,为期28 d。结果表明,Ala-Gln显着提高仔猪的平均日增重,降低料重比(P<0.05);显着增加肝和骨骼肌中Gln和谷氨酸的浓度,降低谷氨酰胺合成酶活性(P<0.05);谷氨酰胺酶和谷氨酸脱氢酶的表达显着增加(P<0.05);肝和骨骼肌中的eI F-4E结合蛋白1(4E-BP1)和核糖体蛋白S5激酶1(S6K1)的磷酸化表达增加。Ala+Gln组对mT OR、4E-BP1和S6K1的磷酸化表达无显着影响(P>0.05)。试验结果表明,饲料中添加Ala-Gln可改善仔猪的生长性能,提高谷氨酰胺代谢,增强肝和骨骼肌中蛋白质合成信号并降低蛋白质在肌肉中的降解信号。(本文来源于《饲料博览》期刊2016年10期）
吴迪炯,徐瑾玉,叶宝东,俞庆宏,高雁婷[5]（2016）在《苦参碱对多发性骨髓瘤细胞凋亡及泛素蛋白酶体通路的影响》一文中研究指出目的观察苦参碱对多发性骨髓瘤细胞株凋亡的影响及可能作用机制。方法以不同浓度的苦参碱(0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml)作用于人多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226和U266,另设蛋白酶体抑制剂MG132为阳性对照。采用MTT法测定苦参碱对两种细胞增殖的抑制率,流式细胞仪检测两种细胞的早期凋亡水平,Western-blot法检测两细胞株泛素(Ub)、20S核心颗粒(p Ab)以及NF-κB信号通路相关蛋白(p-NF-κB p65B、IκBα、p-IκBα、IKKα)表达变化。结果在同等浓度苦参碱作用下,两细胞株细胞在48 h的增殖抑制率较本浓度24 h时明显增加(P<0.05或P<0.01)。随着苦参碱浓度的递增,各细胞株的凋亡率均逐渐增加(P<0.05或P<0.01)。随着苦参碱作用浓度的递增,RPMI 8226细胞Ub水平明显上调,同时p Ab呈进行性下降;而U266细胞Ub表达无明显变化,但p Ab水平同样表达下降。苦参碱能明显抑制两细胞株胞核内p-NF-κB p65B以及胞浆内p-IκBα蛋白表达水平,上调RPMI 8226胞浆内IκBα表达,且以浓度为2.0 mg/ml时作用最明显(P<0.05或P<0.01)。结论苦参碱能促进多发性骨髓瘤细胞的凋亡,并且有一定的浓度时间依赖性,其中的关键因素可能是苦参碱具有抑制蛋白酶体活性的作用。(本文来源于《中医杂志》期刊2016年10期）
丁惠[6]（2016）在《脑外伤后Nrf2-ARE通路对泛素—蛋白酶体系统的作用及机制研究》一文中研究指出第一部分题目：小鼠脑外伤模型中Nrf2-ARE通路对泛素-蛋白酶体系统的作用研究背景：创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)是现代社会中引起脑部损害的主要原因,具有高致死率,高致残率的特点,给人类的生命健康带来了严重的威胁。TBI后神经元的损伤机制主要分为原发性损伤和继发性损伤,原发性损伤是外力作用时即造成的损伤,如挫裂伤、弥漫性轴突损伤等,人为干预无法改变其结果;继发性损伤是受伤之后逐渐出现的,目前发现的病理过程包括线粒体功能损伤、细胞凋亡、氧化应激、钙超载、神经毒性等,积极的处理和预防这些继发性损伤是脑外伤临床治疗的基本原则和意义所在。对于继发性脑损伤,目前尚无确实有效的治疗方法,原因在于继发性脑损伤的机制尚不明确,因此对TBI后继发性损伤机制的研究始终是国内外研究的热点,而从错综复杂的发生机制中找出关键病理通路和信号转导的核心因子是寻找有效的治疗手段的重中之重。核因子E2相关因子2(Nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)是近年来研究比较热门的一个保护因子。生理状态下,Nrf2与胞浆蛋白伴侣分子(Kelch-like ECH-associated protein1, Keap1)结合,并被Keap1传递至泛素—蛋白酶体系统进行降解,活性处于相对抑制状态。在创伤、感染等应激状态或者化学物质如tBHQ,莱菔硫烷的刺激下,Keap1结构发生变相,Nrf2与Keap1解偶联,Nrf2随即进入细胞核,与抗氧化反应元件(Antioxidant response element, ARE)结合,启动ARE调控的保护性因子的表达,提高细胞对各种刺激的抵抗力。研究表明,该通路激活后可以有效表达Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶、抗炎症蛋白等下游分子,而这些分子恰恰涵盖了TBI后多种继发性损伤等防御性机制,如抗氧化应激、减轻炎症损伤、抗细胞凋亡等,从多个方面起到神经保护作用。泛素—蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)作为体内特异性的蛋白降解途径,以其在维持细胞及蛋白质正常功能方面的重要作用越来越受到人们重视,研究发现泛素—蛋白酶体系统受损伤后会导致异常泛素化蛋白聚集,引起细胞功能障碍甚至死亡。在阿尔茨默、帕金森、亨廷顿病等许多神经系统疾病中都已经检测到了大量泛素化蛋白的异常聚集。在颅脑外伤中有学者研究发现脑组织中泛素—蛋白酶体系统受损后导致大量异常的泛素化蛋白聚集,损害脑功能,导致神经功能的障碍：而我们在前期研究也发现外伤后人脑脊液及挫伤组织中有迅速而明显的泛素化水平的增加。这些结果均表明泛素—蛋白酶体系统是神经系统中响应损伤的一种早期反应,在TBI后继发性神经损伤发病中发挥了重要的作用,因此,对TBI后蛋白降解途径的研究具有重要意义。研究表明Nrf2的胞浆伴侣分子Keap1实质上是一种泛素—蛋白连接酶E3,Keap1与Nrf2的相互作用构成了Nrf2信号通路的调控中心。在PC12细胞系中,使用针对UPS通路的抑制剂乳胞素预处理后,可以增强氯化锰诱导的Nrf2活化,与DNA上ARE序列结合,上调一系列保护性因子的表达。这些研究结果提示,Nrf2与UPS系统之间存在密切联系。然而UPS在颅脑创伤中受何种因素调控,又作用于哪些蛋白或基因尚不清楚,本研究将对此进行探讨。目的：本实验主要目的为检测TBI后Nrf2和UPS的表达,并进一步观察在使用UPS抑制剂MG132后小鼠的预后,探讨两者之间可能的调控机制。方法：1.实验动物及分组：使用健康成年雄性ICR小鼠,大小约28-32g;成年雄性Nrf2(-/-)小鼠,大小约28-32g;均有南京军区南京总医院比较医学科提供。按随机数字表法将雄性ICR小鼠随即分为4组：对照组,外伤组,外伤+tBHQ组,外伤+MG132组；Nrf2(-/-)小鼠为外伤组,外伤+MG132组。每组动物均为12只。2.小鼠TBI模型的建立：采用改良的flierl自由落体法制备闭合性小鼠脑损伤模型。常规备皮消毒后将小鼠置于立体定向仪上,沿小鼠头部中线位置切开约1 cm,重力撞击点定位于左侧大脑半球冠状缝后3mm和矢状缝左侧3 mm的交叉点。对照组仅切开头皮,外伤组使用200 g重物自2.5 cm高处自由落体垂直撞击于定位点上。整个过程均在无菌条件下进行,并注意保持硬脑膜完整性。3.药物的处理：tBHQ先配制成浓度为5mg/ml溶于1%DMSO中的溶液,按照50mg/kg计算剂量并于造模前一天经腹腔注射给药；MG132配制成浓度为3mg/ml溶于1%DMSO的溶液,按照20mg/kg计算剂量并于造模前6小时经腹腔注射给药。4.标本的取材和制备：致伤24小时后,将小鼠麻醉后,经左心室灌注等渗盐水(4℃)至肝脏发白后断头开颅取脑。将伤灶周围1mm3的脑组织置于4%戊二醛中保存,用于电镜检测：将伤灶周围3mm的脑组织置于-80℃冰箱保存,用于western blot检测;再经同样途径灌注4%多聚甲醛,之后开颅取脑,置于4%多聚甲醛中固定,然后石蜡包埋,切片,用于免疫组织化学检测及TUNEL细胞凋亡检测。5.神经功能评分：在TBI后1天,3天采用NSS评分对小鼠进行神经功能评分。所得分值越高表示神经功能缺损越严重。6.测定脑水肿：TBI后24小时,将动物处死,迅速取脑,去除脑干及小脑,获得伤灶侧皮层组织。测定每个样品的湿重,然后在80℃烘箱中干燥72h,可获得每个样品的干重。用公式计算脑组织含水量：[(湿重—干重)／湿重]×100%。7.TUNEL细胞凋亡检测：采用TUNEL细胞凋亡试剂盒对脑组织石蜡切片(5μm)进行神经细胞凋亡对检测。同样在高倍镜视野(×400)下每张切片随即选取6个视野对TUNEL阳性细胞进行计数,求出平均值(以每100个细胞中TUNEL阳性细胞对个数来表示阳性),然后进行统计学分析。8.western blot检测：分别利用12%,10%的凝胶电泳分离核蛋白,浆蛋白,检测各组核蛋白,浆蛋白中Nrf2的表达；分别利用8%,15%凝胶电泳分离总蛋白,检测总蛋白中泛素化蛋白及游离泛素的表达。9.免疫组化染色：制作组织切片,利用免疫组化染色方法检测各组中Nrf2的表达,及Nrf2在细胞内的定位情况。10.凝胶电泳迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA):采用EMSA试剂盒对小鼠脑皮层组织进行生物素标记的Nrf2目的DNA的检测。11.乙醇磷钨酸电镜观察泛素化蛋白：外伤模型后24小时,取各组小鼠的脑组织约1mm3,置于4%戊二醛溶液中固定1小时,再分别用30%,505,70%,90%和100%乙醇梯度脱水。新鲜配制乙醇磷钨酸溶液,即10m1100%乙醇中加入O.1g磷钨酸和4滴95%乙醇。乙醇磷钨酸溶液中染色50分钟,中途换液一次。干丙酮中进一步脱水后包埋在Durcupan ACM树脂中,切成薄片后于透射电镜下观察蛋白质聚集物。12.统计学方法：采用SPSS 19.0软件进行统计分析,所有数据以均数±标准差(x±SEM)表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,以P≤0.05为差异具有统计学意义。结果：1.TBI后激活Nrf2表达可以改善神经功能,减少脑水肿和抑制神经细胞的凋亡。与单纯外伤组相比,TBI后外伤+tBHQ组中核蛋白Nrf2明显增高(P<0.001),同时神经功能评分NSS下降(P<0.05),脑组织中水含量降低(P<0.001),神经元凋亡数目减少(P<0.001)。2.TBI激活Nrf2表达可减少异常的泛素化蛋白表达。与单纯外伤组相比,TBI后外伤+tBHQ组泛素化蛋白减少(P<0.05),相对的游离泛素增多(P<0.05)。3.TBI后抑制Nrf2表达可加剧神经功能障碍,增加脑水肿,促进神经细胞的凋亡。与单纯外伤组相比,Nrf2(-／-)小鼠在外伤后核蛋白中Nrf2表达明显降低(P<0.05),同时NSS神经功能评分升高(P<0.05),脑组织中水含量增多(P<0.05),神经元凋亡数目变多(P<0.05)。4.TBI后抑制Nrf2表达可增加异常的泛素化蛋白的表达。与单纯外伤组相比,Nrf2(-/-)小鼠在外伤后泛素化蛋白增多(P<0.05),相对的游离泛素减少(P<0.05)。5.在Nrf2(+／+)小鼠中使用MG132后可显着增加泛素化蛋白的表达,并且明显加剧神经细胞的凋亡,而在Nrf2(-/-)小鼠中使用MG132后泛素化蛋白表达没有明显改变,并且不影响神经细胞的凋亡水平。在Nrf2(+／+)小鼠中,给予MG132抑制UPS活性后(P<0.01),外伤组比对照组中神经元凋亡程度更严重(P<0.001)；在Nrf2(-/-)小鼠中,给予MG132后泛素化蛋白表达没有明显改变(P>0.05),且外伤组和对照组中神经元凋亡水平没有统计学差异(P>0.05)。结论：1.TBI后激活Nrf2表达引起泛素化蛋白的减少,表明UPS活性增高；TBI后抑制Nrf2表达引起泛素化蛋白的增加,表明UPS活性下降。2.Nrf2可能通过调控UPS来发挥神经保护作用。第二部分题目：小鼠脑外伤模型中Nrf2-ARE通路调控泛素—蛋白酶体系统的可能机制研究背景：在第一部分实验中,我们初步检测了TBI后Nrf2和UPS的表达变化,发现UPS随着Nrf2表达含量的增高而活性升高,随着Nrf2表达含量的抑制而活性下降,并且在Nrf2基因敲除小鼠身上使用UPS抑制剂后UPS活性并无显着改变。因此,我们有理由相信Nrf2可能通过调控UPS来最终发挥神经保护作用,接下来我们将进一步探讨其中可能的调控机制。有文献研究显示在使用蛋白酶抑制剂MG132后,可以观察到还原型谷胱甘肽(GSH)含量减少,伴随着高活性分子活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的增多；同时GSH作为Nrf2-ARE下游激活的一个因子,与Nrf2之间的关系十分紧密,文献证实Nrf2-GSH通路的功能障碍直接影响Ⅱ型细胞的生长,增加对氧化剂的敏感性,从而损伤细胞。以上结果均表明,以GSH/ROS为代表的氧化还原平衡与Nrf2和UPS之间关系密切。目的：本实验通过激活或抑制Nrf2表达来检测GSH/ROS水平,同时通过激活或抑制GSH/ROS表达来检测UPS活性的高低,探讨Nrf2与UPS之间可能的调控机制。方法：1.实验动物及分组：使用健康成年雄性ICR小鼠,大小约28-32g；成年雄性Nrf2(-/-)小鼠,大小约28-32g；均有南京军区南京总医院比较医学科提供。按随机数字表法将雄性ICR小鼠随即分为4组：对照组,外伤组,外伤+tBHQ组,外伤+FAC组,外伤+NAC组；将Nrf2(-／-)小鼠分为外伤组。2.小鼠TBI模型的建立：采用改良的flierl自由落体法制备闭合性小鼠脑损伤模型。常规备皮消毒后将小鼠置于立体定向仪上,沿小鼠头部中线位置切开约1 cm,重力撞击点定位于左侧大脑半球冠状缝后3mm和矢状缝左侧3mm的交叉点。对照组仅切开头皮,外伤组使用200 g重物自2.5 cm高处自由落体垂直撞击于定位点上。整个过程均在无菌条件下进行,并注意保持硬脑膜完整性。3.药物的处理：tBHQ先配制成浓度为5mg/ml溶于1%DMSO中的溶液,按照50mg/kg计算剂量并于造模前一天经腹腔注射给药；FAC先配制成浓度为1ug/ul溶于0.9%生理盐水中,按照2.5ul／只剂量于造模前经侧脑室给药；NAC先配制成浓度为30mg/mL溶于0.9%生理盐水中,按照150mg/kg于TBI后5分钟,6小时分两次经腹腔给药。4.标本的取材和制备：致伤24小时后,将小鼠麻醉后,经左心室灌注等渗盐水(4℃)至肝脏发白后断头开颅取脑。将伤灶周围3mm的脑组织置于-80℃冰箱保存,用于GSH, ROS及western blot检测：经同样途径灌注4%多聚甲醛,之后开颅取脑,置于4%多聚甲醛中固定,然后石蜡包埋,切片,用于免疫组织化学检测；再经同样途径灌注等渗盐水(4℃)之后开颅取脑置于-800C冰箱保存,梯度蔗糖脱水后固定包埋冰冻切片,用于免疫荧光化学检测。5.检测脑组织中GSH和ROS含量：根据GSH和ROS检测试剂盒说明书进行操作,使用酶标仪进行测量,用Bradford法测定总蛋白。GSH含量和ROS强度分别用umol/L, fluorescence intensity/mg.protein来表示。6.免疫荧光化学检测：制备组织冰冻切片,利用免疫荧光双染方法检测脑组织中ROS的表达以及在神经元细胞,细胞核中的分布情况。7.western blot检测：利用8%凝胶电泳分离总蛋白,检测总蛋白中泛素化蛋白的表达。8.免疫组织化学检测：制作石蜡组织切片,利用免疫组化染色方法检测泛素化蛋白的表达。9.统计学方法：采用SPSS 19.0软件进行统计分析,所有数据以均数±标准差(x±SEM)表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,以P≤0.05为差异具有统计学意义。结果：1.TBI后使用tBHQ可以引起GSH含量增高,ROS表达强度下降。与单纯外伤相比,TBI后使用tBHQ可以明显增高GSH表达含量(P<0.05),而且ROS表达强度明显变弱(P<0.0001)。2.TBI后Nrf2(-／-)小鼠中GSH含量降低,ROS表达强度增高。与单纯外伤组相比,TBI后Nrf2(-／-)小鼠中GSH表达含量明显降低(P<0.05),ROS表达强度明显增高(P<0.0001)。3.TBI后激活ROS表达强度后,GSH的含量显着下降,泛素化蛋白表达明显增多。与单纯外伤组相比,使用FAC刺激ROS生成后(P<0.0001),出现GSH含量的下降(P<0.05),和泛素化蛋白的增多(P<0.01)。4.TBI后抑制ROS表达强度后,GSH的含量,泛素化蛋白的表达明显减少。与单纯外伤组相比,使用NAC抑制ROS生成后(P<0.0001),出现GSH含量的升高(P<0.05),和泛素化蛋白的减少(P<0.05)。结论：1.TBI后激活表达Nrf2,可以增加GSH含量,同时减少ROS表达强度；TBI后抑制表达Nrf2,可以明显减少GSH含量,同时显着增强ROS表达强度。2.TBI后激活表达ROS,可以使GSH的含量显着下降,泛素化蛋白表达明显增多,UPS活性下降；TBI后抑制表达ROS,可以使GSH的含量显着增高,泛素化蛋白表达明显减少,UPS活性增高。3.Nrf2通过氧化还原平衡(GSH/ROS)来调控UPS的活性。第叁部分题目：神经元TBI模型中Nrf2-ARE通路对泛素-蛋白酶体系统(UPS)的作用研究背景：在以上实验中,我们初步在小鼠脑外伤模型中探讨来Nrf2可能是通过调节氧化还原平衡反应进而影响UPS活性来起到神经保护作用。但是在体外环境中这条通路是否存在,还有待于进一步验证。目的：在体外环境中验证Nrf2,氧化还原平衡,UPS叁者之间的关系。方法：1.神经元的培养：选取孕17-19天的成年雌性ICR及Nrf2(-/-)小鼠,断颈处死后,放入酒精中消毒。剪开腹部暴露子宫,分离胎囊。显微操作小心去除脑干,将剩余脑皮层中软脑膜,血管膜逐一清除后进行神经元的消化,并种板至6孔板中继续培养7天至神经元成熟后再行后续实验。2.神经元的分组及外伤模型：培养成熟后的ICR神经元随即分为：对照组,外伤组,外伤+tBHQ组,外伤+FAC组,外伤+NAC组；培养成熟后的Nrf2(-/-)神经元分为外伤+敲除组；神经元TBI模型采用经典的划伤模型,即使用lul枪头在六孔板中按照每隔4mm间隔划线,每个孔中约划9x9个小格子,即为神经元的外伤模型。3.药物的处理：用培养基配制tBHQ至最终浓度为10uM,于TBI前2小时加入六孔板中,每孔加入2ml；用培养基配制FAC至最终浓度为200uM,于TBI前4小时加入六孔板中,每孔加入2m1；用培养基配制NAC至最终浓度为200uM,于TBI后6小时加入六孔板中,每孔加入2ml。4. western blot检测：分别利用12%,10%的凝胶电泳分离核蛋白,浆蛋白,检测各组核蛋白,浆蛋白中Nrf2的表达；分别利用8%凝胶电泳分离总蛋白,检测总蛋白中泛素化蛋白的表达。5.实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)：按照试剂盒说明,进行目标基因Nrf2的qPCR检测。6.活性氧(reactive oxygen species, ROS)的荧光检测：按照试剂盒说明进行操作,先原位装载探针,孵育20分钟后清洗3遍,一部分进行荧光显微镜的观察,一部分进行流氏细胞仪检测测定荧光强度,使用488nm激发波长,525nm发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。7.统计学方法：采用SPSS 19.0软件进行统计分析,所有数据以均数±标准差(x±SEM)表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,以P≤0.05为差异具有统计学意义。结果：1.神经元TBI模型后激活Nrf2的表达可以有效促进Nrf2的核转移,同时减弱ROS的表达。使用tBHQ激活Nrf2的表达,与单纯外伤组相比发现TBI后Nrf2的核转移增加(P<0.05),同时ROS的荧光强度变弱(P<0.001)。2.神经元TBI模型后抑制Nrf2的表达可以有限降低Nrf2的核转移,同时ROS的表达增强。使用Nrf2(-／-)孕鼠培养成熟的神经元中Nrf2含量显着降低(P<0.05),与单纯外伤组相比TBI后Nrf2核转移减少(P<0.001),同时ROS的表达强度明显增强(P<0.01)。3.神经元TBI模型后激活ROS的表达可以增加泛素化蛋白的表达。与单纯外伤组相比,使用FAC可以显着激活ROS的表达(P<0.01),同时发现泛素化蛋白增多(P<0.01)。4.神经元TBI模型后抑制ROS的表达可以减少泛素化蛋白的表达。与单纯外伤组相比,使用NAC可以显着抑制ROS的表达(P<0.001),同时发现泛素化蛋白减少(P<0.05)。结论：1.神经元TBI模型中激活Nr2表达可以减少ROS的表达；抑制Nr2的表达可以增加ROS的表达。2.神经元TBI模型中激活ROS表达可以降低UPS的活性；神经元TBI模型中抑制ROS表达可以增加UPS的活性。(本文来源于《南方医科大学》期刊2016-05-13）
庞军,程文立,张钲[7]（2015）在《泛素蛋白酶体通路及其与动脉粥样硬化斑块关联研究进展》一文中研究指出泛素蛋白酶体系统(UPS)是细胞内非溶酶体途径蛋白降解通路,在生物体内负责大多数细胞周期过程中蛋白降解及异常蛋白降解,可维持蛋白质稳定状态、调节细胞程序性死亡、控制细胞周期、条件信号转导通路、介导受体内吞、I型抗原加工呈递和炎症反应等。当前相关研究显示,泛素蛋白酶体通路通过炎症机制促进动脉粥样硬化相关疾病的发生发展。故本文就UPS的组成及其在动脉粥样硬化发生发展中作用的新进展、前景做一综述。(本文来源于《中国循环杂志》期刊2015年09期）
王世超,吕鑫,吴江[8]（2015）在《泛素蛋白酶体通路与动脉粥样硬化》一文中研究指出泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)是广泛存在于真核细胞中的,依赖ATP的选择性蛋白质降解的主要途径。泛素的主要功能是标记细胞中需要降解的蛋白质,使其被26S蛋白酶体识别和降解。UPP主要通过介导细胞中蛋白的降解而发挥调节作用。该通路的异常与许多疾病诸如肿瘤、遗传性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病等密切相关。本文主要综述了UPP在动脉粥样硬化的发生,发展和复合病变中的作用。(本文来源于《四川解剖学杂志》期刊2015年02期）
朱剑军,朱晓华,黄平,蒋辉,邓世山[9]（2015）在《泛素蛋白酶体系统在Wnt通路中的研究进展》一文中研究指出Wnt信号传导通路是一个由多种分子参与、相互影响、相互制约和协同作用的复杂体系,与细胞信号转导、细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡、细胞黏附和迁移以及干细胞的分化潜能等有关。泛素蛋白酶体系统通过调控蛋白活性、亚细胞定位以及蛋白间相互作用等方式在细胞活动中发挥重要的作用。Wnt信号传导通路中β-catenin等关键分子受泛素蛋白酶体途径精密调控。本文就泛素蛋白酶体系统和Wnt通路信号传导相互之间的关系作一综述。(本文来源于《川北医学院学报》期刊2015年02期）
唐珍,罗蓉[10]（2014）在《泛素——蛋白酶体通路与疾病发生的研究进展》一文中研究指出泛素-蛋白酶体通路(UPP)由泛素、蛋白酶体及3个相关的酶组成,是体内蛋白质降解的途径之一。蛋白酶体活性测定方法、UPP调控蛋白酶体活性、UPP与神经退行性疾病和恶性肿瘤发生、发展及治疗的关系是目前研究的热点。(本文来源于《兰州大学学报(医学版)》期刊2014年03期）
泛素蛋白酶体通路论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的对泛素蛋白酶体通路与阿尔茨海默病之间的关系进行正确的认识,进一步了解AD的病理机制,明确AD治疗靶点。方法查阅相关研究文献资料,从AD的病理学特点、AD脑中APP的代谢、UPP系统的组成和功能、UPP与Tau的过度磷酸化聚集进行综述。结果和结论泛素蛋白酶体通路受抑制或功能缺陷在Tau的过度磷酸化/聚集和β-分泌酶活性增加引起Aβ聚集终致AD发病中至关重要。开发安全高效的泛素蛋白酶体调节剂发挥抑制BACE1的活性作用,减少Aβ增加聚集和Tau蛋白过度磷酸化等,抑制病理产物形成PHF,SP和NFTs的产生是科研新思路。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
泛素蛋白酶体通路论文参考文献
[1].吴晓绵.泛素蛋白酶体系统SCR-βTrcp和CYLD通过NFκB信号通路对颅颌面组织改建的调控作用[C].2017全国口腔生物医学学术年会论文汇编.2017
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[6].丁惠.脑外伤后Nrf2-ARE通路对泛素—蛋白酶体系统的作用及机制研究[D].南方医科大学.2016
[7].庞军,程文立,张钲.泛素蛋白酶体通路及其与动脉粥样硬化斑块关联研究进展[J].中国循环杂志.2015
[8].王世超,吕鑫,吴江.泛素蛋白酶体通路与动脉粥样硬化[J].四川解剖学杂志.2015
[9].朱剑军,朱晓华,黄平,蒋辉,邓世山.泛素蛋白酶体系统在Wnt通路中的研究进展[J].川北医学院学报.2015
[10].唐珍,罗蓉.泛素——蛋白酶体通路与疾病发生的研究进展[J].兰州大学学报(医学版).2014
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