基于CRISPR-Cas的肺炎克雷伯杆菌的噬菌体抗性：生物信息学分析和工程菌构建

论文摘要

噬菌体感染是微生物发酵工业面临的一个棘手问题,至今仍无良策。本研究致力于探索基于CRISPR-Cas技术的噬菌体感染问题的解决方案。本文以肺炎克雷伯杆菌为例,从噬菌体的分离与分析开始,探究了天然CRISPR-Cas系统与（前）噬菌体之间的相互作用关系,建立了基于CRISPR-Cas9的噬菌体基因组编辑技术,探索了增强CRISPR-Cas9的噬菌体抗性水平的方法。本文的研究既包括利用公共数据库中的资源从生物信息学的角度进行的理论分析,也有从实验的角度对相关问题进行的探索论证。主要研究结果如下:首先,对感染肺炎克雷伯杆菌工业发酵菌株的噬菌体进行了分离、生理特性和基因组分析,并考察了噬菌体感染对1,3-丙二醇发酵过程的影响。系统进化树的分析结果显示,噬菌体phiKpS2属于Kp34属肺炎克雷伯杆菌噬菌体,是一类在自然界分布广泛的克雷伯杆菌噬菌体。发酵实验表明,噬菌体感染会导致发酵长时间停滞,发酵周期延长,生产效率降低。此外,发现噬菌体感染对细胞生长和代谢的影响与感染时细胞所处生长阶段有密切关系。其次,对肺炎克雷伯杆菌的CRISPR-Cas系统和前噬菌体进行了系统的生物信息学分析。鉴定出了一种新的Ⅰ型CRISPR亚型,命名为I-E*,并对其基本特征包括在染色体上的位置、基因的组织结构、Cas蛋白、tracrRNA的结构、PAM位点和进化来源等进行了确定;CRISPR间隔序列主要来源于噬菌体、前噬菌体和质粒,提示其主要功能是防止外来遗传元件入侵。揭示了前噬菌体是肺炎克雷伯杆菌基因组可塑性的重要原因之一;在全球范围内流行的CG258型菌株含有较多高度保守的前噬菌体,包括其特有的两个P2-P4噬菌体系统;肺炎克雷伯杆菌染色体上的获得型抗生素抗性基因（aARGs）集中存在于CG258型和CRISPR 阳性菌株中,其中CG258型菌株的aARGs有60%位于前噬菌体区域,而CRISPR 阳性菌株的aARGs仅有10%位于前噬菌体区域,显示CRISPR-Cas系统和CG258的前噬菌体可能分别独立地参与了ARG在染色体上的整合。发现CRISPR-Cas系统和前噬菌体的分布都依赖与菌株的MLST分型,且CRISPR中存在高比例的自我靶向的间隔序列:这些可能是在肺炎克雷伯杆菌中CRISPR-Cas系统对前噬菌体的存在影响有限的原因。接着,对5株潜在肺炎克雷伯杆菌工业菌株的前噬菌体诱导性进行了检测,对其中一株菌的前噬菌体诱导过程进行了定量分析,并对诱导出的两个前噬菌体进行了全基因组分析。实验结果显示,肺炎克雷伯杆菌在丝裂霉素C（MMC）诱导下易发生前噬菌体大量增殖,细胞裂解死亡。其中,肺炎克雷伯杆菌W3的基因组中有2个可诱导的前噬菌体,且存在自发诱导现象。诱导出的噬菌体PKPW3.1和PKPW3.3在NCBI phage数据库中没有同源噬菌体,说明是新的噬菌体类型。对前噬菌体携带的tRNA分析显示,PKPW3.1和PKPW3.3中含有三种tRNA（tRNA-Arg,tRNA-Asn,tRNA-Thr）,是肺炎克雷伯杆菌前噬菌体中最常见的tRNA类型。前噬菌体在基因组中的高丰度、可诱导性及自发诱导性,说明在以肺炎克雷伯杆菌为基础的发酵工业中前噬菌体是导致噬菌体感染的风险因素之一。然后,建立了一种基于CRISPR-Cas9的肺炎克雷伯杆菌噬菌体基因组编辑技术。揭示了30-60 bp的短同源臂可以高效地实现包括点突变、基因删除和插入、移码突变在内的多种遗传操作,从而大大简化了基于CRISPR-Cas的噬菌体基因组编辑中繁琐的模板构建过程。通过对177个sgRNA的预测活性与实际测定活性的相关性分析,证实来源于真核生物的sgRNA预测模型不能用来预测针对噬菌体的sgRNA活性。揭示了低活性的sgRNA也可以用来进行基于同源重组的噬菌体基因组编辑,通过移码突变可以快速的判断噬菌体基因的必需性;并以噬菌体phiKpS2为例,通过移码突变和基因删除等,对其17%的基因的必需性进行了初步验证。最后,分析了针对噬菌体的sgRNA的活性分布,考察了噬菌体从单一靶标和多靶标CRISPR-Cas系统中逃逸的机制,发现通过表达Mu Gam干扰噬菌体DNA双链断裂修复可显著增强CRISPR-Cas系统噬菌体抗性。在针对噬菌体的sgRNA中,活性低的sgRNA数量较多。在177个sgRNA中,活性最低的那部分,即EOP>0.1的sgRNA约占49.7%,而EOP<10-4,即活性最高的那部分sgRNA仅占4.5%。噬菌体有多种逃逸CRISPR-Cas系统的方式,包括非同源末端接合、同源重组和靶向区域的大片度删除。5个sgRNAs串联的多靶标CRISPR-Cas系统可促进靶向区域的大片段删除,但没有显著增强菌株的噬菌体抗性。发现Mu Gam蛋白可显著增强CRISPR-Cas系统噬菌体抗性,且这种增强效应对不同活性的sgRNA均适用。表达Mu Gam后噬菌体逃逸的方式发生了改变,逃逸噬菌体中野生型和发生靶向区域大片段删除的突变体都增加了。未来在对肺炎克雷伯杆菌发酵菌株选育的过程中需要进行前噬菌体的诱导性检测,或考虑开发基于CRISPR-Cas系统的前噬菌体清除技术;另外,通过对噬菌体双链断裂修复机制的深入研究,未来可以设计更好的干扰策略来防止噬菌体逃逸。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要缩写表
• 主要符号表
• 1 绪论
•   1.1 噬菌体
•     1.1.1 噬菌体研究简史
•     1.1.2 噬菌体的感染和繁殖机制
•     1.1.3 噬菌体与宿主之间的相互作用
•       1.1.3.1 宿主的噬菌体抗性机制
•       1.1.3.2 噬菌体的适应机制
•     1.1.4 噬菌体的宿主谱
•   1.2 前噬菌体
•   1.3 CRISPR-Cas系统
•   1.4 肺炎克雷伯杆菌
•     1.4.1 肺炎克雷伯杆菌感染与防治
•     1.4.2 肺炎克雷伯杆菌生产生物基化学品的研究进展
•     1.4.3 肺炎克雷伯杆菌的噬菌体、前噬菌体及CRISPR-Cas系统
•   1.5 工业发酵过程中的噬菌体感染与防治
•     1.5.1 噬菌体感染及危害
•     1.5.2 噬菌体感染防治现状
•       1.5.2.1 污染源的控制
•       1.5.2.2 菌株轮换使用
•       1.5.2.3 传统的基因工程策略
•     1.5.3 基于CRISPR-Cas系统的噬菌体抗性策略
•   1.6 论文选题及设计思想
• 2 一株感染产1,3-丙二醇克雷伯杆菌的噬菌体的分离与分析
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 实验使用的菌株、噬菌体及实验条件
•     2.2.2 噬菌体的分离与纯化
•     2.2.3 噬菌体形态的透射电镜测定
•     2.2.4 噬菌体基因组提取和限制性内切酶分析
•     2.2.5 噬菌体最佳感染复数的测定
•     2.2.6 噬菌体吸附速率的测定
•     2.2.7 噬菌体一步生长曲线的测定
•     2.2.8 噬菌体的温度、pH、紫外照射敏感性测定
•     2.2.9 噬菌体效价及发酵产物的分析方法
•     2.2.10 噬菌体phiKpS2全基因组测序及基因注释
•     2.2.11 生物信息学分析方法
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 噬菌体的分离及形态
•     2.3.2 噬菌体的限制性内切酶分析
•     2.3.3 噬菌体感染动力学
•     2.3.4 噬菌体的稳定性
•     2.3.5 噬菌体感染对肺炎克雷伯杆菌生长的影响
•     2.3.6 噬菌体感染对肺炎克雷伯杆菌发酵产1,3-丙二醇的影响
•     2.3.7 噬菌体phiKpS2的基因组注释与分析
•     2.3.8 噬菌体phiKpS2的比较基因组分析
•   2.4 本章小结
• 3 肺炎克雷伯杆菌中CRISPR-Cas系统和前噬菌体的生物信息学分析及诱导性前噬菌体的检测
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 实验所用菌种及其分型方法
•     3.2.2 CRISPR-Cas系统、前噬菌体和抗生素抗性基因的鉴定
•     3.2.3 CRISPR-Cas间隔序列来源与系统特征分析
•     3.2.4 前噬菌体的诱导
•     3.2.5 透射电镜分析
•     3.2.6 细菌及噬菌体基因组提取
•     3.2.7 基因组测序与注释
•     3.2.8 RT-PCR分析
•     3.2.9 基因组比对与可视化方法
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 克雷伯杆菌中CRISPR-Cas系统的多样性和组织结构
• *的来源分析'>    3.3.2 肺炎克雷伯杆菌中CRISPR-Cas新亚型I-E^*的来源分析
•     3.3.3 CRISPR间隔序列与克雷伯杆菌MLST型
•     3.3.4 CRISPR间隔序列的来源
•     3.3.5 肺炎克雷伯杆菌CRISPR系统中存在的自我靶向的间隔序列
•     3.3.6 前噬菌体在肺炎克雷伯杆菌中的分布
•     3.3.7 肺炎克雷伯杆菌及前噬菌体的比较基因组分析
•     3.3.8 CG258型肺炎克雷伯杆菌中几个特征性前噬菌体
•     3.3.9 前噬菌体与CRISPR-Cas系统的相互作用
•     3.3.10 前噬菌体与染色体编码的抗生素基因的关系
•     3.3.11 肺炎克雷伯杆菌前噬菌体可诱导性检测
•     3.3.12 前噬菌体诱导性的定量分析
•     3.3.13 可诱导前噬菌体的基因组分析
•     3.3.14 讨论
•   3.4 本章小结
• 4 基于CRISPR-Cas9的噬菌体基因组编辑
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 细菌、噬菌体和培养条件
•     4.2.2 质粒构建方法
•     4.2.3 sgRNA活性的评估
•     4.2.4 重组噬菌体的分离与分析方法
•     4.2.5 数据分析
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 构建适用于肺炎克雷伯杆菌的SpCas9-sgRNA系统
•     4.3.2 评估sgRNA在基于CRISPR-Cas9的噬菌体抗性中的活性
•     4.3.3 不同CRISPR靶点的噬菌体突变模式比较
•     4.3.4 噬菌体phiKpS2的基因组编辑
•       4.3.4.1 通过短同源臂进行噬菌体点突变
•       4.3.4.2 通过短同源臂进行噬菌体基因的删除和交换
•       4.3.4.3 噬菌体基因的移码突变
•       4.3.4.4 弱sgRNA用于噬菌体基因组删除及可能的机制
•     4.3.5 通过基因编辑对phiKpS2中几个基因必要性的初步确定
•     4.3.6 讨论
•   4.4 本章小结
• 5 基于CRISPR-Cas9增强细菌噬菌体抗性的策略
•   5.1 引言
•   5.2 实验材料与方法
•     5.2.1 细菌、噬菌体和培养条件
•     5.2.2 sgRNA活性的评估
•     5.2.3 质粒构建方法
•     5.2.4 重组噬菌体的分离与分析方法
•     5.2.5 数据分析方法
•   5.3 结果与讨论
•     5.3.1 sgRNA在噬菌体抗性中的活性分布
•     5.3.2 单靶标CRISPR-Cas9系统的噬菌体抗性
•     5.3.3 多靶标CRISPR-Cas9系统的噬菌体抗性
•     5.3.4 Mu Gam可显著增强CRISPR-Cas9系统的噬菌体抗性
•     5.3.5 讨论
•   5.4 本章小结
• 6 结论与展望
•   6.1 结论
•   6.2 创新点
•   6.3 展望
• 参考文献
• 作者简介
• 攻读博士学位期间科研项目及科研成果
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 沈俊涛

导师: 修志龙

关键词: 噬菌体,肺炎克雷伯杆菌,基因组编辑,噬菌体抗性,生物信息学分析

来源: 大连理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 大连理工大学

分类号: Q78;Q811.4

总页数: 173

文件大小: 19974K

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