α-淀粉酶共表达系统的研究及在枯草芽孢杆菌中最优信号肽的筛选

论文摘要

现如今,α-淀粉酶大量用于食品、饲料产业中,本研究试图通过优化枯草芽孢杆菌表达系统中的信号肽,从而提高淀粉酶产量,解决淀粉酶异源表达中出现的“瓶颈”。另外,随着人们对酶制剂应用的多元化,希望一个蛋白具有多种酶学特性,使生产成本得到降低,因此开发多功能组合酶制剂将成为一定的趋势。在研究淀粉酶的基础上,通过对木聚糖酶和α-淀粉酶融合蛋白共表达的研究,帮助我们更深刻地了解到共表达系统的作用机制,为今后关于不同酶制剂之间融合蛋白的共表达提供一些有价值的参考。1、本研究以曲霉属（Aspergillus lacticoffeatus）的α-淀粉酶AmyCBS 101883和瘤胃真菌类（Neocallimastix patriciarum）木聚糖酶XynCDBFV作为主要研究对象,利用Linker Database数据库筛选三条适用于糖苷水解酶类的连接肽,通过基因重叠延伸技术（Splicing by Ovedap Extension,SOE）的手段构建出木聚糖酶与α-淀粉酶的共表达融合蛋白。并将其分别导入大肠杆菌与毕赤酵母中诱导表达。以单一酶Amy-E2和Amy-pGAP为参照,研究其酶学特性。结论如下:在pH适应性与稳定性方面:Amy-E2与融合蛋白Xyn-Amy-E2中α-淀粉酶最适pH均为7.5,当pH低于7.0时Amy-E2酶活迅速下降,而Xyn-Amy-E2在pH 4.5-7.5之间其相对剩余酶活仍保持在70%以上,在酸性条件下有较好的适应性。Linker 1连接的融合蛋白,不仅在pH 6.5及pH 7.5的环境下相对剩余酶活仍保持在95%左右,pH 8.5碱性条件下的适应性也最优,且使融合蛋白中的α-淀粉酶活性提高了23%。此外,在真核表达系统中,α-淀粉酶的pH适应性均属中偏碱性,且融合蛋白α-淀粉酶在酸性条件下优于参照酶。在温度适应性与稳定性方面:Xyn-Amy-E2热稳定性最优,耐受处理50 min后接近半衰期。融合蛋白Xyn-L2-Amy-pGAP和Xyn-L3-Amy-pGAP在55-70℃范围内有很好的适应性,相对剩余酶活在65%以上,优于参照酶Amy-pGAP。通过以上融合表达发现:在同一表达系统中,融合后表达的α-淀粉酶活性均低于单一α-淀粉酶。Xyn-Amy、Xyn-L1-Amy、Xyn-L2-Amy、Xyn-L3-Amy分别下降了36.9%、21.6%、59.0%、39.0%。当引入连接肽Linker 1时,使融合α-淀粉酶活性提高了23%。大肠杆菌中α-淀粉酶的平均酶活为0.571 U/mL,真核系统中α-淀粉酶的活性为4.208 U/mL。2、本研究以枯草芽胞杆菌表达系统pBE-S为骨架,构建来源于解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）α-淀粉酶基因（DL-3-4-1）的混合信号肽筛选文库。通过电转化的方法转入到枯草芽孢杆菌（B.subtilis）菌株RIK1285中。基于96孔板微量培养,对1920株菌株的发酵液上清进行检测,对酶活位于前100的菌株进行测序。经筛选获得14条优化表达的信号肽:yomL、PhrA、PhrF、YvbX、YoqH、mpr、YuaB、YqxI、YjcM、ywoF、PhrK、peI、YceG、YddT、yobb。其中,引导α-淀粉酶最高效分泌的信号肽yomL,酶活为113.251 U/mL。进一步对其酶学性质进行分析如下:最适pH为6.5,且在中偏碱性条件下的稳定性较好,最适温度为65℃。在65℃、70℃、80℃条件下耐受1 h,其半衰期依次为80 min、70 min、40 min,表明其热稳定性较强。其中Triton x-100、Mn2+、EDTA、Ni2+、Co2+对DL-3-4-1有激活作用;SDS、Al3+、Cu2+对该酶有一定抑制作用;Ag+、β-mercaptoethanol对该酶完全抑制。此外,该酶对来自植物种子、根茎类的粗淀粉均有很好的水解作用,有较为广泛的运用价值。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 淀粉的概况
•     1.1.1 淀粉来源与种类
•     1.1.2 淀粉的分子及结构特点
•   1.2 淀粉酶的概况
•     1.2.1 淀粉酶的定义及分类
•     1.2.2 淀粉酶的结构特点及作用机制
•     1.2.3 淀粉及淀粉酶的应用
•     1.2.4 淀粉酶的研究进展
•   1.3 研究目的和意义
•   1.4 研究内容
•   1.5 技术路线
• 第2章 木聚糖酶与α-淀粉酶融合蛋白基因与不同表达载体的构建与表达
•   2.1 融合连接肽Linker的选择
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 菌株和质粒
•     2.2.2 主要仪器
•     2.2.3 主要试剂
•     2.2.4 常用溶液
•     2.2.5 常用培养基
•     2.2.6 PCR引物合成与DNA测序
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 大肠杆菌重组α-淀粉酶基因Amy-pEasy-E2 与木聚糖酶基因Xyn-pEasy-E2 融合模板的构建
•     2.3.2 大肠杆菌表达系统中Linker连接的重组木-淀融合蛋白基因Xyn-Amy-E2、Xyn-L1-Amy-E2、Xyn-L2-Amy-E2、Xyn-L3-Amy-E2 的构建
•     2.3.3 重组木-淀融合蛋白基因在大肠杆菌中的诱导表达
•     2.3.4 融合重组酶Xyn-Amy-E2、Xyn-L1-Amy-E2、Xyn-L2-Amy-E2、Xyn-L3-Amy-E的纯化
•     2.3.5 重组酶Xyn-Amy-E2、Xyn-L1-Amy-E2、Xyn-L2-Amy-E2、Xyn-L3-Amy-E2中α-淀粉酶酶学性质的研究
•     2.3.6 毕赤酵母菌重组α-淀粉酶基因Amy-pGAP与木聚糖酶基因Xyn-pGAP融合模板的构建
•     2.3.7 毕赤酵母菌表达系统中Linker连接的重组木聚糖酶-α-淀粉酶融合蛋白基因Xyn-Amy-pGAP、Xyn-L1-Amy-pGAP、Xyn-L2-Amy-pGAP、Xyn-L3-Amy-pGAP的构建
•     2.3.8 重组木-淀融合蛋白基因质粒在毕赤酵母菌中的诱导表达
•     2.3.9 重组酶Xyn-Amy-pGAP、Xyn-L1-Amy-pGAP、Xyn-L2-Amy-pGAP、Xyn-L3-Amy-pGAP中 α-淀粉酶酶学性质的研究
•   2.4 实验结果与分析
•     2.4.1 融合连接肽Linker的选择及序列分析
•     2.4.2 大肠杆菌重组α-淀粉酶基因Amy与木聚糖酶基因Xyn融合模板的构建
•     2.4.3 大肠杆菌表达系统中Linker连接的重组木-淀融合蛋白基因Xyn-Amy-E2、Xyn-L1-Amy-E2、Xyn-L2-Amy-E2、Xyn-L3-Amy-E2 的构建
•     2.4.4 重组木-淀融合蛋白质粒在大肠杆菌中的诱导表达
•     2.4.5 重组酶Xyn-Amy-E2、Xyn-L1-Amy-E2、Xyn-L2-Amy-E2、Xyn-L3-Amy-E2中α-淀粉酶酶学性质的研究
•     2.4.6 毕赤酵母菌重组α-淀粉酶基因Amy与木聚糖酶基因Xyn融合模板的构建
•     2.4.7 毕赤酵母菌表达系统中Linker连接的重组木-淀融合蛋白基因Xyn-Amy-pGAP、Xyn-L1-Amy-pGAP、Xyn-L2-Amy-pGAP、Xyn-L3-Amy-pGAP的构建
•     2.4.8 重组木-淀融合蛋白基因质粒在毕赤酵母菌中的诱导表达
•     2.4.9 重组酶Xyn-Amy-pGAP、Xyn-L1-Amy-pGAP、Xyn-L2-Amy-pGAP、Xyn-L3-Amy-pGAP中 α-淀粉酶酶学性质的研究
•   2.5 讨论
•   2.6 本章小结
• 第3章 α-淀粉酶DL-3-4-1 在枯草芽孢杆菌中的高效表达以及最优信号肽的筛选
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 菌株和质粒
•     3.1.2 主要仪器
•     3.1.3 主要试剂
•     3.1.4 常用溶液
•     3.1.5 常用培养基
•     3.1.6 DNA测序与引物合成
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 枯草芽孢杆菌pBE-S-DL-3-4-1 信号肽筛选模板质粒的构建
•     3.2.2 枯草芽孢杆菌分泌混合信号肽DNA文库pBE-S-SP-DL-3-4-1 质粒的构建
•     3.2.3 pBE-S-SP-DL-3-4-1 混合信号肽质粒文库在枯草芽孢杆菌表达系统中的表达
•     3.2.4 最优信号肽引导分泌α-淀粉酶酶学性质的研究
•     3.2.5 α-淀粉酶水解产物的分析
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 枯草芽孢杆菌pBE-S-DL-3-4-1 信号肽筛选模板质粒的构建
•     3.3.2 pBE-S-SP-DL-3-4-1 混合信号肽质粒文库在枯草芽孢杆菌表达系统中的表达
•     3.3.3 α-淀粉酶DL-3-4-1 酶学特性的研究
•   3.4 讨论
•   3.5 本章小结
• 第4章 总结与展望
•   4.1 总结
•     4.1.1 木-淀融合蛋白基因与不同表达载体的构建与表达
•     4.1.2 α-淀粉酶DL-3-4-1 在枯草芽孢杆菌中的高效表达以及最优信号肽的筛选
•   4.2 创新
•   4.3 展望
• 参考文献
• 附录
•   附录A 实验中所使用的缓冲液的配制
•   附录B 本文所涉及到的氨基酸序列
•   附录C 本文所涉及到的核苷酸序列
•   附录D 氨基酸中英文对照及缩写表
• 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 蒋蕊

导师: 黄遵锡

关键词: 淀粉酶,共表达,枯草芽孢杆菌表达系统,信号肽

来源: 云南师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 云南师范大学

分类号: Q78;Q55

总页数: 113

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