唾液酸酶异源表达、酶学性质以及其生物转化制备神经节苷脂GM1应用的研究

论文摘要

本研究构建了分泌表达唾液酸酶的重组枯草芽孢杆菌WB800N-pHT43-sia,优化了产酶条件,在TB培养基中,添加1 mM的诱导剂,30℃下诱导18 h后酶活最高,达到401 U/mL,比优化前酶活（192.8 U/mL）提高了2.1倍。利用生长细胞体系转化多唾液酸神经节苷脂（GLS）生产单唾液酸神经节苷脂（GM1）,10g/L的GLS在优化产酶后的生长细胞体系中转化2d后,GLS全部转化成GM1,GM1的浓度从初始的0.12 mg/mL增加到2.23 mg/mL,比优化前体系中GM1浓度提高了两倍多。研究了重组唾液酸酶的酶学性质,最适温度为37℃,最适pH为6.5,在pH 5.5-7.0的范围内酶活较稳定。唾液酸酶的Km值为0.15 mmol/L,Vmax为0.69μmol/min。唾液酸对唾液酸酶的抑制类型为竞争性抑制,抑制常数为0.15 mmol/L。将透析（一种在位分离技术）应用到游离酶催化GLS生产GM1的体系中,解除了唾液酸对唾液酸酶的抑制作用。50 g/L GLS,10000 U/mL酶量,12 h后GLS全部转化为GM1,GM1的含量从0.42 mg/mL增加到了10.88 mg/mL,而对照组中还有神经节苷脂GD1a的残余,GM1含量仅增加到6.87 mg/mL。透析的使用有效的解除了唾液酸对唾液酸酶的抑制作用,使得反应朝向目标产物生成的方向顺利进行。使用D301树脂对体系游离唾液酸的吸附率达到89.2%,甲酸对树脂上的唾液酸解析率达到83.7%,唾液酸的总回收率为74.7%。D301树脂对体系中游离的唾液酸进行了高效回收。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 神经节苷脂
•     1.1.1 单唾液酸神经节苷脂（GM1）结构与特性
•     1.1.2 神经节苷脂的药理研究与临床应用
•     1.1.3 唾液酸的生物学功能
•   1.2 微生物法制备GM1
•   1.3 唾液酸酶
•   1.4 原位分离技术（in situ product removal,简称ISPR）
•   1.5 本课题的研究内容及意义
• 第二章 唾液酸酶枯草芽孢杆菌表达体系构建
•   2.1 引言
•   2.2 实验仪器
•   2.3 实验材料
•     2.3.1 菌株与质粒
•     2.3.2 实验试剂
•     2.3.3 培养基与相关试剂配方
•   2.4 实验方法
•     2.4.1 重组枯草芽孢杆菌的构建
•     2.4.2 微生物的培养
•     2.4.3 枯草芽孢杆菌重组蛋白表达的验证
•     2.4.4 重组枯草芽孢杆菌产唾液酸酶条件优化
•     2.4.5 生长细胞体系转化多唾液酸神经节苷脂生产GM1
•     2.4.6 薄层层析法（TLC）对神经节苷脂转化的分析
•     2.4.7 高效液相色谱法对产物（GM1）的分析
•   2.5 实验结果
•     2.5.1 唾液酸酶目的基因的扩增
•     2.5.2 重组质粒pHT43-sia的构建
•     2.5.3 枯草芽孢杆菌重组菌落PCR验证
•     2.5.4 重组枯草芽孢杆菌生长曲线
•     2.5.5 目的蛋白诱导表达结果
•     2.5.6 重组菌产唾液酸酶条件优化
•     2.5.7 生长细胞体系转化多唾液酸神经节苷脂生产GM1
•   2.6 本章小结
• 第三章 重组唾液酸酶酶学性质研究
•   3.1 引言
•   3.2 实验仪器
•   3.3 实验试剂
•   3.4 实验方法
•     3.4.1 唾液酸酶的硫酸铵沉淀
•     3.4.2 蛋白含量的测定
•     3.4.3 温度对唾液酸酶酶活的影响
•     3.4.4 pH对唾液酸酶酶活的影响
•     3.4.5 金属离子及化学试剂对唾液酸酶酶活的影响
•     3.4.6 唾液酸酶的动力学常数
•     3.4.7 唾液酸对唾液酸酶的抑制类型和抑制常数的测定
•   3.5 实验结果
•     3.5.1 唾液酸酶的硫酸铵分级沉淀
•     3.5.2 温度对唾液酸酶酶活的影响
•     3.5.3 pH对唾液酸酶酶活的影响
•     3.5.4 金属离子与化学试剂对唾液酸酶酶活的影响
•     3.5.5 唾液酸酶的动力学常数
•     3.5.6 唾液酸对唾液酸酶抑制类型和抑制常数的测定
•   3.6 本章小结
• 第四章 原位分离技术解除唾液酸对唾液酸酶酶活抑制作用
•   4.1 引言
•   4.2 实验仪器
•   4.3 实验试剂
•   4.4 实验方法
•     4.4.1 薄层层析法（TLC）对神经节苷脂转化的分析
•     4.4.2 高效液相色谱法（HPLC）测定GM1
•     4.4.3 高效液相色谱法（HPLC）测定唾液酸
•     4.4.4 透析体系解除唾液酸对唾液酸酶的抑制作用
•     4.4.5 唾液酸吸附回收中树脂的选择
•   4.5 实验结果
•     4.5.1 透析解除唾液酸对唾液酸酶的抑制作用
•     4.5.2 唾液酸吸附回收树脂的选择
•     4.5.3 D301树脂对唾液酸的吸附回收
•   4.6 本章小结
• 第五章 总结与展望
•   5.1 总结
•   5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表论文情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 宋岩松

导师: 王学东

关键词: 单唾液酸神经节苷脂,唾液酸酶,枯草芽孢杆菌,透析,树脂

来源: 华东理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 华东理工大学

分类号: Q78;Q55

总页数: 76

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