‘南通小方柿’赤霉素不敏感基因DkGAI2的克隆与功能分析

论文摘要

【目的】对DkGAI2的亚细胞定位及表达特性进行分析,并将DkGAI2转化烟草,分析转基因烟草的生理和形态指标,为GAI的深入研究提供理论基础。【方法】以‘南通小方柿’高通量转录组测序结果中标注的GAI2为原始序列（未发表）,利用RT-PCR,3′RACE和5′RACE技术从‘南通小方柿’中克隆得到DkGAI2的序列全长。利用生物信息学分析其序列特征,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析DkGAI2在‘大方柿’及‘南通小方柿’5个不同物候期的表达特性以及DkGAI2在‘南通小方柿’不同组织中的表达特性,构建瞬时表达载体pCAMBIA-GFP-1302-DkGAI2,并瞬时侵染烟草分析DkGAI2的亚细胞定位,通过构建DkGAI2植物双元表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草,经过GUS染色、RT-PCR对转基因烟草株系进行鉴定;并将野生型和转基因烟草移栽,于第一朵花开放时测定转基因植株的株高、节间长度、叶片长宽比以及GA1和GA4含量。【结果】从‘南通小方柿’中克隆得到了1 827 bp的DkGAI2,DkGAI2核苷酸序列与猕猴桃（KF588651.1）、光皮烨（MF149049.1）、砂梨（KX078214.1）、苹果（FJ535245.1）、葡萄（MG738718.1）的相似度达72%-80%,DkGAI2具有DELLA蛋白家族特有的DELLA结构域,属于DELLA蛋白基因家族。DkGAI2编码608个氨基酸,相对分子质量为66.5 kD,理论等电点为5.54,不稳定系数为50.41,无明显疏水区,无跨膜区,无信号肽。序列系统进化分析结果显示,DkGAI2与葡萄亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示,DkGAI2在‘南通小方柿’5个不同物候期的表达量都高于‘大方柿’;DkGAI2在‘南通小方柿’不同组织中表现出组织表达特异性,其中,在老叶中表达量最高,其次为茎尖和幼叶,而在幼果中几乎不表达。pCAMBIA-GFP-1302-DkGAI2融合蛋白的绿色荧光信号位于细胞核中,表明DkGAI2编码蛋白位于细胞核。经过GUS染色和RT-PCR检测,共获得5个转DkGAI2烟草株系,转基因烟草叶片GA1含量增加,GA4含量降低,GA1和GA4总含量降低,且转基因烟草植株出现植株矮化、节间缩短、叶片长宽比降低及花期延迟的表型。【结论】DkGAI2具有组织表达特异性,定位于细胞核,DkGAI2在‘南通小方柿’5个不同物候期的表达量均高于‘大方柿’。推测DkGAI2可能通过降低GA4的含量进而引起植株矮化。

论文目录

• 0 引言
• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 植物材料
•     1.1.2 各种酶及生化试剂
•     1.1.3菌株及载体
•   1.2 方法
•     1.2.1 DkGAI2中间片段的克隆
•     1.2.2 Dk GAI2 3′端的获得
•     1.2.3 DkGAI2 5′端的获得
•     1.2.4 DkGAI2序列分析
•     1.2.5 Dk GAI2的亚细胞定位
•       1.2.5. 1 Dk GAI2瞬时表达载体的构建
•       1.2.5. 2 瞬时侵染本氏烟草叶片
•     1.2.6 实时荧光定量PCR
•     1.2.7 表达载体PBI121-DkGAI2的构建
•     1.2.8 农杆菌介导法遗传转化烟草及转基因烟草的鉴定
•     1.2.9 转基因烟草GA1和GA4含量的测定
•     1.2.1 0 转基因烟草叶绿素含量的测定
•     1.2.1 1 转基因烟草形态指标的测定
•     1.2.1 2 数据统计与分析
• 2 结果
•   2.1 基因克隆与序列分析
•   2.2 DkGAI2的物候期表达特性
•   2.3 DkGAI2的组织表达特异性
•   2.4 DkGAI2基因的亚细胞定位
•   2.5 转基因烟草的鉴定
•   2.6 转基因烟草的生理指标测定
•   2.7 转基因烟草的形态指标测定
• 3 讨论
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 蒋梦婷,朱宁,龚洪泳,侯应军,余心怡,渠慎春

关键词: 南通小方柿,基因克隆,亚细胞定位,组织特异性表达

来源: 中国农业科学 2019年19期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,园艺

单位: 南京农业大学园艺学院

基金: 国家公益性行业（农业）科研专项经费项目(201203047)

分类号: S665.2;Q943.2

页码: 3417-3429

总页数: 13

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