胞内劳森菌LI1035靶向酵母和哺乳动物的MAPK通路并调节其肌动蛋白组成

论文摘要

胞内劳森氏菌（Lawsonia intracellularis）是一种新的专性胞内寄生革兰氏阴性细菌,被鉴定为多种动物（主要是猪）的传染性疾病增殖性肠病（PE）的病原。胞内劳森菌基因组序列表明其具有III型分泌系统（T3SS）,在细菌入侵和逃避宿主固有免疫系统的过程中起辅助作用,是诱导细胞增殖的机制之一。T3SS（T3ES）通常以保守的真核细胞过程为目标,而T3ES在胞内分泌的效应因子尚未见报道。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一个已建立的成熟的模型系统用于揭示其功能,通常在实验室中分析病原体特异性基因产物的功能。通过酿酒酵母菌株表达进行细胞内所有假想基因的生长抑制筛选,首次发现LI1035具有抑制酵母生长的作用。14株丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated proteinkinase,MAPK）酵母单倍体缺失株中,有2株恢复LI1035对细胞生长的抑制作用,提示LI1035与酵母中MAPK通路的组分相互作用。磷酸化分析证实LI1035在酵母和哺乳动物细胞中抑制MAPK信号通路。肌动蛋白染色分析表明,LI1035调节酵母和哺乳动物细胞的肌动蛋白组织。胞内劳森菌LI1035作为假定的效应蛋白会改变MAPK途径,调节宿主的肌动蛋白组织。为了确定外源蛋白在酿酒酵母细胞中的共定位提供参考,构建酿酒酵母荧光定位报告菌株。运用染色体同源重组的方法,将突变的、已进行酵母表达优化红色荧光蛋白RedStar整合到12个酵母细胞器标记蛋白的C端,与之进行融合表达,用特异性引物对每一个酵母荧光定位报告菌株进行菌落PCR验证,用激光共聚焦显微镜进行荧光检测和形态特征观察,对线粒体和细胞核进行了特异性染料染色,用GFP标记沙门氏菌已知定位蛋白SipA,与构建的相应荧光定位报告菌株进行共定位。构建的酿酒酵母荧光定位报告菌株可分别标示酵母细胞的内质网、过氧化物酶体、脂滴、初级内吞体、次级内吞体、顺式高尔基体、反式高尔基体及线粒体。菌落PCR、荧光检测、染料与相应报告菌株的共定位、已知定位蛋白SipA与相应报告菌株的共定位均提示报告菌株构建成功。这些报告菌株的构建,为日后在酵母中观察细胞器动态变化,以及未知蛋白在酵母中的定位提供了基础性工具。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 猪增生性肠炎
•     1.1.1 背景
•     1.1.2 流行性
•     1.1.3 临床表现型
•     1.1.4 病理变化
•     1.1.5 诊断
•   1.2 胞内劳森菌
•   1.3 Ⅲ型分泌系统
•   1.4 酿酒酵母—替代宿主模型
•   1.5 酿酒酵母MAPK信号通路
•   1.6 哺乳动物MAPK信号通路
•   1.7 肌动蛋白细胞骨架
•   1.8 本论文研究的目的及意义
• 第二章 胞内劳森菌假定蛋白在酿酒酵母中的生长与表达
•   2.1 引言
•     2.1.1 胞内劳森菌未定义功能未知基因作为酵母生长抑制的候选基因
•     2.1.2 回肠炎疫苗DNA作为胞内劳森菌扩增模板
•     2.1.3 酵母中表达胞内劳森菌基因的考虑因素
•     2.1.4 同源重组方法将外源基因导入酵母细胞
•     2.1.5 温度和胁迫条件设定
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 材料
•     2.2.2 方法
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 酵母诱导表达载体的构建
•     2.3.2 胞内劳森菌LI1035 在液体培养基中抑制酵母W303-1A生长
•     2.3.3 胞内劳森菌LI1035 在固体培养基中抑制酵母W303-1A生长
•     2.3.4 胞内劳森菌LI1035 在固体培养基中抑制酵母BY4741 生长
•     2.3.5 胞内劳森菌LI1035 在酵母中的表达检测
•     2.3.6 胞内劳森菌LI1035 在胁迫条件下对酵母生长的影响
•   2.4 小结与讨论
•     2.4.1 回肠炎疫苗DNA可作为胞内劳森菌基因扩增的模板
•     2.4.2 筛选到多个抑制酵母生长的胞内劳森菌基因
•     2.4.3 胞内劳森菌LI1035 抑制酵母生长与质粒拷贝数、菌株背景无关
•     2.4.4 高温及山梨醇部分挽救LI1035 引起的酵母生长抑制
• 第三章 胞内劳森菌LI1035 在酵母基因单缺失株文库中的筛选
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 材料
•     3.2.2 方法
•   3.3 实验结果与分析
•     3.3.1 文库筛选结果
•     3.3.2 SLT2和KSS1 回补株质粒构建
•     3.3.3 SLT2和KSS1 回补株质粒转入酵母表型验证
•     3.3.4 酵母MAPK通路非必需基因缺失对LI1035 生长抑制检测
•   3.4 小结与讨论
•     3.4.1 SLT2 挽救胞内劳森菌LI1035 表达引起的生长抑制
•     3.4.2 KSS1 挽救LI1035 表达引起的生长抑制
•     3.4.3 酵母MAPK通路其它非必需基因缺失不挽救LI1035 抑制酵母生长..
• 第四章 胞内劳森菌LI1035 在酵母中功能的初步探究
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 材料
•     4.2.2 方法
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 胞内劳森菌LI1035 在酵母细胞中磷酸化水平的检测
•     4.3.2 胞内劳森菌LI1035 对酵母细胞骨架的影响
•   4.4 小结与讨论
•     4.4.1 胞内劳森菌LI1035 抑制CWI通路SLT2 的磷酸化
•     4.4.2 胞内劳森菌LI1035 不抑制信息素通路中KSS1 的磷酸化
•     4.4.3 胞内劳森菌LI1035 不抑制高渗/甘油通路中HOG1 的磷酸化
•     4.4.4 胞内劳森菌LI1035 干扰酵母极化
• 第五章 胞内劳森菌LI1035 在哺乳动物细胞中功能的初步探究
•   5.1 引言
•   5.2 材料与方法
•     5.2.1 材料
•     5.2.2 方法
•   5.3 结果与分析
•     5.3.1 哺乳动物表达载体构建
•     5.3.2 胞内劳森菌LI1035 在标准条件下不影响哺乳动物细胞磷酸化水平
•     5.3.3 胞内劳森菌LI1035在EGF条件下抑制哺乳动物细胞磷酸化水平
•     5.3.4 LI1035-EGFP 转染哺乳动物细胞
•     5.3.5 胞内劳森菌LI1035 调节哺乳动物肌动蛋白细胞骨架
•   5.4 小结与讨论
•     5.4.1 胞内劳森菌LI1035 抑制哺乳动物MAPK磷酸化
•     5.4.2 胞内劳森菌LI1035 调节哺乳动物细胞骨架
• 第六章 酿酒酵母荧光定位报告菌株的开发及鉴定
•   6.1 引言
•     6.1.1 构建酵母荧光报告菌株的目的
•     6.1.2 构建酿酒酵母荧光报告菌株的方法
•   6.2 材料与方法
•     6.2.1 材料
•     6.2.2 方法
•   6.3 结果与分析
•     6.3.1 酿酒酵母定位报告基因的选择
•     6.3.2 带有目的基因同源臂的标记基因的扩增
•     6.3.3 酿酒酵母细胞的转化及鉴定
•     6.3.4 酿酒酵母荧光标记的荧光显微镜观察
•     6.3.5 与小分子染料特异染色的共定位分析
•     6.3.6 沙门氏菌SipA-EGFP融合表达质粒的构建
•     6.3.7 沙门氏菌SipA与肌动蛋白标记的酿酒酵母的共定位分析
•   6.4 小结与讨论
•     6.4.1 酿酒酵母荧光报告菌株
•     6.4.2 沙门氏菌SipA与肌动蛋白标记的酿酒酵母的共定位分析
• 第七章 总结及展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨丽娟

导师: 赖芬菊,桑毅

关键词: 胞内劳森菌,信号通路,肌动蛋白,蛋白定位,酵母报告菌株

来源: 江西农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江西农业大学

分类号: Q78

DOI: 10.27177/d.cnki.gjxnu.2019.000291

总页数: 67

文件大小: 6162K

下载量: 52